Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".
6.1. Серологические методы
Принадлежность холерных вибрионов к O1 или O139 серогруппе
определяют в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с
холерными агглютинирующими сыворотками O1, Инаба, Огава, РО и с
холерной сывороткой O139 серогруппы в соответствии с инструкциями по
применению препаратов, а также в других реакциях с иммуноглобулиновыми
препаратами, предназначенными для ускоренной диагностики холеры и
идентификации возбудителя.
Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в
чашку Петри, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и
(или) агаровую 12 - 18-часовую культуру и сыворотки O1 серогруппы в
разведении 1:50 - 1:100. Сыворотку O139 разводят в соответствии с
указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями
культуры в 0,9-процентном растворе хлорида натрия.
Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по
общепринятой методике в соответствии с инструкцией по применению
диагностических сывороток.
Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить
развернутую реакцию в 0,3-процентном растворе NaCl.
Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3-процентным
раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине
диагностического титра. Суспензию изучаемой культуры готовят в этом
9 9
же растворе концентрацией 3 х 10 - 5 х 10 м.к./мл в объеме 8 - 10 мл.
Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 - 1,5 ч. В
реакции используют поверхностный слой микробной взвеси, разведенной
0,3-процентным раствором натрия хлорида до концентрации 1 млрд.
м.к./мл, добавляя ее по 0,5 мл во все разведения сыворотки, и контроль
культуры (0,5 мл 0,3-процентного раствора натрия хлорида + 0,5 мл
взвеси культуры). Учет и оценка результатов аналогичны основному
варианту развернутой реакции.
Флюоресцентно-серологический метод (МФА - метод флюоресцирующих
антител).
Метод дает возможность ускоренно идентифицировать выделенную
культуру, а также выявить возбудителя холеры O1 серогруппы при
5
содержании его в исследуемом материале не менее чем 10 м.к./мл.
Исследованию подлежат выделенная культура, нативный материал
(испражнения и рвотные массы) и материал после подращивания.
Порядок приготовления мазков, обработка их флюоресцирующими
иммуноглобулинами, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими
для всех бактерий, описаны в "Наставлениях по применению
иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих холерных
адсорбированных лошадиных сухих".
Положительный результат может быть получен через 1,5 - 2 ч от
начала исследования.
При просмотре мазков, обработанных иммуноглобулином холерным
флюоресцирующим, особое внимание следует обращать на морфологию
светящихся микробов, т.к. в отдельных случаях в мазках из испражнений
здоровых людей может наблюдаться свечение микроорганизмов,
отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки,
кокки).
Для устранения неспецифического свечения целесообразно
использовать в качестве "гасителя" бычий альбумин, меченный родамином.
Методика его использования описана в "Инструкции по применению
альбумина бычьего, меченного родамином, сухого".
Для выявления в исследуемом материале холерных вибрионов O139
серогруппы, в связи с отсутствием в настоящее время препарата
специфических флюоресцирующих иммуноглобулинов, при наличии кроличьей
агглютинирующей сыворотки к вибрионам этой серогруппы возможно
использование непрямого метода иммунофлюоресценции, который описан в
"Инструкции по применению сыворотки диагностической антивидовой против
иммуноглобулинов кролика люминесцирующей сухой".
Реакция иммобилизации вибрионов под влиянием специфических
холерных сывороток O1 и O139 серогрупп (РИВ).
Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение
нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не менее
5
10 м.к./мл. На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 2 капли
испражнений, рвотных масс или поверхностного слоя среды обогащения.
Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй
добавляют каплю O1 сыворотки в разведении 1:50, перемешивают и также
накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю смотрят под
микроскопом при увеличении х 400 - 600, используя фазово-контрастное
устройство или конденсор темного поля.
При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой
капле наблюдают характерную подвижность, во второй - иммобилизацию
отдельных микробных клеток и образование неподвижных микроагглютинатов
немедленно или в течение 1 - 2 мин. В случае неспецифического
взаимодействия с диагностическими сыворотками наблюдается образование
мелких подвижных конгломератов при активной подвижности отдельных
клеток.
Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый
сигнальный ответ через 15 - 20 мин. от начала исследования нативного
материала. При отрицательном результате исследование повторяют после
подращивания в 1-процентной пептонной воде.
В случае отрицательного результата необходимо провести
аналогичное исследование с холерной сывороткой O139 серогруппы,
которую разводят 1:5.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием
диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового.
Порядок подготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и
ее учет изложены в "Инструкции по применению диагностикума
эритроцитарного холерного антительного иммуноглобулинового",
прилагаемой к препарату.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".