Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".
6.6. Оценка эпидемической значимости холерных
вибрионов
6.6.1. Определение гемолитической активности (по Грейгу).
К 1 мл 18 - 24-часовой культуры, выращенной в 4 - 5 мл
мясопептонного бульона или сердечно-мозгового инфуза, добавляют 1 мл
1-процентной взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в
физиологическом растворе. Смесь бульонной культуры и эритроцитов
осторожно перемешивают встряхиванием и помещают на 2 ч в термостат при
температуре (37,0 +/- 0,5) ёC, а затем в холодильник до следующего
дня. Предварительный учет результатов проводят через 2 ч,
окончательный - на следующий день. При положительной реакции наступает
полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (1
мл бульона + 1 мл взвеси эритроцитов) гемолиз отсутствует. Чистоту
опыта следует контролировать путем высева "смеси" на агаровую среду.
Для постановки пробы Грейга может быть использована
дефибринированная кровь барана, консервированная борной кислотой или
консервантом Алсевера. Консервированные эритроциты сохраняют свои
свойства в течение 3 месяцев. Перед постановкой пробы на гемолиз
дефибринированную кровь центрифугируют при 2 - 3 тыс. об./мин. в
течение 15 мин., надосадочную жидкость удаляют, а осевшие эритроциты
отмывают 0,9-процентным раствором хлорида натрия 2 - 3 раза с
промежуточным центрифугированием до получения прозрачной надосадочной
жидкости. Из отмытых эритроцитов приготавливают 1-процентную взвесь в
0,9-процентном растворе хлорида натрия, которую можно хранить при
температуре 4 ёC 2 - 3 дня и использовать для постановки пробы Грейга
описанным выше способом. (Рецепты консервантов см. раздел 7.)
6.6.2. Определение эпидзначимости холерных вибрионов эльтор
комплексным методом - по отношению к диагностическим холерным
бактериофагам эльтор ctx+ и ctx- в соответствии с наставлением к
препаратам и гемолитической активности.
Методика определения гемолитической активности описана выше.
Для постановки пробы с фагом используют метод агаровых слоев.
Испытуемую культуру в объеме 0,5 мл добавляют пипеткой в пробирку с
5,0 мл 0,5 - 0,7% агара Мартена рН 7,6 +/- 0,2, расплавленного и
охлажденного до 45 ёC. После перемешивания все содержимое выливают на
подсушенную поверхность агара Мартена рН 7,6 +/- 0,2 в чашку Петри.
После застывания слоя агара с культурой на его поверхность наносят
цельные фаги эльтор ctx+ и ctx-. После высыхания капель фагов чашки
переворачивают агаром вверх и инкубируют при температуре (37,0 +/-
0,5) ёC.
По лизису фагами и гемолитической активности в пробе Грейга
исследуемые штаммы относят к эпидемически опасным (I группа, вариант
1) и эпидемически неопасным (III группа, варианты 6, 7, 8) или к
требующим дополнительных исследований для заключения об их
эпидзначимости (группа II, варианты 2, 3, 4, 5) (см. табл. 6).
Таблица 6
СХЕМА
ОЦЕНКИ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ V. CHOLERAE ELTOR
ПО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К БАКТЕРИОФАГАМ CTX+ И CTX- И
ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
-------------------------------------------------------------------
|Группы |Варианты|Гемолиз |Чувствительность|Оценка эпидемической |
| | |по |к фагам |значимости |
| | |Грейгу |----------------| |
| | | |ctx+ | ctx- | |
|-------|--------|--------|------|---------|----------------------|
|I |1 |- |+ | - |Эпидемически опасны |
|-------|--------|--------|------|---------|----------------------|
|II |2 |- |- | - |Для оценки |
| | | | | |эпидемической |
| | | | | |значимости необходимы |
| | | | | |дополнительные |
| | | | | |исследования на |
| | | | | |наличие |
| | | | | |генов ctx AB, tcp A |
| | | | | |или |
| | | | | |определение |
| | | | | |токсигенности |
| | | | | |на кроликах-сосунках |
| |3 |- |+ | + | |
| |4 |+ |+ | + | |
| |5 |+ |+ | - | |
|-------|--------|--------|------|---------|----------------------|
|III |6 |+ |- | + | Эпидемически не |
| | | | | |опасны |
| |7 |+ |- | - | |
| |8 |- |- | + | |
-------------------------------------------------------------------
6.6.3. Определение токсигенности холерных вибрионов на модели
кроликов-сосунков.
Исследования проводят в лабораториях, имеющих разрешение на
экспериментальную работу с микроорганизмами I - II групп патогенности.
Для заражения животных используют 4-часовую агаровую культуру,
выращенную при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC или 18-часовую - при
температуре (20,0 +/- 1,0) град. С. Необходимо использовать две
5 7
заражающие дозы: 1 х 10 и 1 x 10 м.к., которые вводят внутрикишечно в
объеме по 0,2 мл двум кроликам. Заражающую дозу контролируют путем
высева на две чашки щелочного агара 0,1 мл взвеси из разведения
3
1 x 10 м.к./мл. Кроликов 10 - 12-дневных, массой 130 - 160 г,
фиксируют к станку брюшком вверх, выстригают шерсть на операционном
поле и смазывают его йодом. Дают эфирный или внутримышечно
тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1-процентного раствора на 100 г массы).
Делают разрез длиною 1 см по средней линии живота на уровне пупка.
Извлекают петлю тонкого кишечника на длинной брыжейке, фиксируют с
помощью мягкого пинцета и вводят взвесь вибрионов. Петлю погружают в
брюшную полость, брюшную стенку и кожу послойно зашивают. Шов
смазывают йодом. Оперированных крольчат кормят с помощью шприца
молоком и наблюдают 48 ч. Всех погибших и умерщвленных через 48 ч
животных вскрывают и делают высев содержимого кишечника на чашки
щелочного агара. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в толстом
кишечнике, который растянут бесцветной или светло-желтой прозрачной
или слегка опалесцирующей жидкостью. Слепая кишка и прилегающие отделы
толстого кишечника могут быть настолько растянуты, что сквозь них
видны подлежащие петли кишечника, что создает видимость полной
прозрачности кишечного содержимого. Тонкий кишечник расширен и также
заполнен полупрозрачным содержимым. Описанные изменения характерны для
"синдрома холерогенности", наблюдаемого при заражении эпидемически
опасными, содержащими ген холерного токсина штаммами.
Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы холерных
вибрионов вызывают гибель большинства зараженных животных дозами
5 7
1 x 10 и 1 x 10 м.к. в течение первых двух суток с описанным выше
типичным "синдромом холерогенности".
Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина,
не вызывают гибели животных и изменений в кишечнике или обуславливают
накопление в кишечнике выживших или павших животных мутной,
коричневато-желтой жидкости, т.е. развитие энтеропатогенного синдрома,
связанного с реализацией других факторов патогенности.
Обязательной проверке на модели кроликов-сосунков, при отсутствии
возможности определения эпидзначимости другими методами, подлежат
следующие штаммы V. cholerae O1 и O139 серогрупп:
а) выделенные от людей:
- гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов O139 серогруппы;
- гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;
- гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов O1 серогруппы,
атипичные по серологическим свойствам и устойчивые к фагам эльтор и
ctx+;
б) выделенные из объектов окружающей среды:
- гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов O1 и O139
серогрупп, выделенные при отсутствии эпидосложнений по холере.
6.6.4. Определение генов холерного токсина (ctx AB).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Методом ПЦР проводят определение генов холерного токсина (ctx AB)
и токсинкорегулируемых пилей (tcp A).
В основе ПЦР лежит амплификация (умножение) участка генома,
ограниченного парой специфических праймеров, путем многократного
копирования при помощи фермента - термостабильной ДНК-полимеразы
(Taq-полимеразы). Образование в результате реакции фрагментов ДНК
ожидаемого размера свидетельствует о наличии в пробе специфической
ДНК.
Материал для исследования.
Материалом для исследования могут быть: биологический материал
(испражнения, рвотные массы), объекты окружающей среды (вода
поверхностных водоемов, смывы с поверхностей, стоки, ил), чистые
культуры вибрионов, I и II пептонная вода.
Подготовка проб для ПЦР.
Подлежащие исследованию пробы испражнений или рвотных масс в
объеме 1 мл (1 г) помещают в стерильные флаконы и добавляют 49 мл
0,9-процентного раствора натрия хлорида. Суспендируют встряхиванием и
отстаивают в течение 10 мин. Затем для отделения крупных частиц
центрифугируют в течение 5 мин. при 4000 (600 об./мин.). Надосадочную
жидкость центрифугируют в течение 15 мин. при 8000 (12000 об./мин.),
после чего осадок суспендируют в 100 мкл 0,9-процентного раствора
натрия хлорида или дистиллированной воды. Подготовленную таким образом
пробу обеззараживают.
Воду из поверхностных водоемов (стоки) забирают в объеме 1 л в
стерильные флаконы, закрытые ватной пробкой. Центрифугируют в полном
объеме в течение 15 мин. при 8000 g (12000 об./мин.). Осадок
ресуспендируют в 1000 или 100 мкл дистиллированной воды. Пробы
обеззараживают.
Подозрительные колонии, выросшие на плотной питательной среде,
суспендируют в 50 мкл дистиллированной воды в микропробирке объемом
1,5 мл.
Чистые культуры вибрионов, выросших на плотной питательной среде,
суспендируют петлей в 2 мл 0,9-процентного раствора хлорида натрия и
доводят концентрацию микробных взвесей до 5 единиц по стандартному
9
образцу мутности (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1 x 10
м.к./мл для вибрионов. Затем готовят 10-кратные разведения взвесей в
дистиллированной воде до необходимой концентрации, с учетом
чувствительности используемой ПЦР-тест-системы. Отбирают по 1 мл
соответствующих разведений в микропробирки объемом 1,5 мл и
обеззараживают.
При исследовании пептонной воды ее центрифугируют в течение 15
мин. при 8000 g (12000 об./мин.). Осадок ресуспендируют в 100 мкл
дистиллированной воды и обеззараживают.
Обеззараживание проб.
Все пробы обеззараживают путем кипячения в течение 30 мин., что
обеспечивает инактивацию культур холерных вибрионов согласно п. 3.1.46
СП 1.2.011-94.
Выделение ДНК.
Из подготовленных и обеззараженных таким образом проб проводят
выделение ДНК с помощью сертифицированных наборов для выделения ДНК и
согласно прилагаемой к набору инструкции. При исследовании чистых
культур этап выделения ДНК опускают, для постановки ПЦР используют
обеззараженные кипячением бактериальные взвеси.
Постановка ПЦР.
Для постановки ПЦР используют разрешенные комитетом МИБП к
применению в практике здравоохранения ПЦР-тест-системы. Работу
выполняют согласно прилагаемой к тест-системе инструкции. Амплификацию
проводят на программируемых термоциклерах отечественного и зарубежного
производства.
Учет результатов ПЦР.
Для учета результатов ПЦР используют электрофорез в агарозном или
полиакриламидном геле. Условия проведения электрофореза, визуализации
результатов и их учет отражены в инструкциях к ПЦР-тест-системам.
При этом следует обратить внимание на следующие моменты:
Если в положительном контроле отсутствует специфическая полоса
(ошибка в постановке реакции, неправильное хранение или загрязнение
реактивов в процессе работы, сбой программы амплификатора) - требуется
повторная постановка реакции.
Если в отрицательном контроле выявляется специфическая полоса на
уровне положительного контроля (контаминация реактивов положительной
ДНК или продуктами амплификации) - необходимо поставить дополнительные
отрицательные контроли на этапе постановки ПЦР. Если результат
повторяется - необходимо сменить реактивы.
Наличие полос ампликонов, располагающихся выше или ниже
контрольной полосы, является неспецифическим ответом, и результат
реакции оценивается как отрицательный.
Молекулярное зондирование.
Молекулярное зондирование холерных вибрионов на наличие ctx гена
проводят с помощью зонда, сконструированного в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи,
представляющего собой Hinc II-Xba I фрагмент ДНК холерного вибриона
эльтор размером 0,84 т.п.н., содержащий полную последовательность гена
ctx А и большую часть ctx В.
Исследования с использованием радиоактивной метки могут быть
проведены в учреждениях, имеющих право работы с радиоактивными
изотопами. Для изучения используют суточные агаровые культуры холерных
вибрионов или их отпечатки на нитрозоцеллюлозных фильтрах,
обработанных по специальной методике для обеспечения специфической
стерильности и безопасности при пересылке почтой.
Для получения отпечатков 3 - 6-часовую бульонную культуру
холерных вибрионов, выращенную при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC,
наносят бактериологической петлей или штампом-репликатором на
поверхность щелочного агара и выращивают при температуре (37,0 +/-
0,5) ёC 18 - 24 ч для получения колонии 2 - 3 мм в диаметре.
Нитрозоцеллюлозный фильтр (Hybond С или Schleicher & Schuel, Germany)
накладывают на поверхность агара с колониями, через 1 мин. (после
промокания фильтра) снимают и помещают отпечатками колоний вверх на
фильтровальную бумагу, смоченную 0,5М NaOH, через 5 мин. перекладывают
на новую бумагу, смоченную тем же раствором, и выдерживают еще 5 мин.
При этом происходит лизис клеток (визуально - колонии принимают вид
капель слизи) и денатурация ДНК.
Фильтр переносят на фильтровальную бумагу, смоченную
нейтрализующим буфером 1. Процедуру повторяют 3 - 4 раза с интервалом
в 5 мин., всякий раз используя свежую бумагу, смоченную этим буфером.
Фильтр подсушивают на воздухе на сухом листе фильтровальной
бумаги в течение 5 - 10 мин. и промывают 2 - 3 раза по 10 мин. при
комнатной температуре в 20 - 30 мл нейтрализующего буфера 2. Фильтр
помещают колониями вверх на поверхность раствора и через 1 - 2 мин.
погружают в него.
Фильтр высушивают на воздухе и прогревают при температуре (80,0
+/- 0,5) ёC в течение 1,5 - 2 ч для фиксации денатурированной ДНК.
Обработанный таким образом фильтр помещают между двумя листами
фильтровальной бумаги в полиэтиленовый пакет, запаивают и пересылают в
плотной упаковке (желательно картонной).
Приготовление буферных смесей.
Нейтрализующий буфер 1
(0,2М трис-HCl, рН 7,5 +/- 0,1 + 1М NaCl):
1М трис-HCl - 20 мл
5М NaCl - 20 мл
H2O - до 100 мл.
Для приготовления исходного 1М трис-HCl буфера рН 7,5 +/- 0,1
навеску сухого трис-основания (121,1 г) растворяют в 600 мл
дистиллированной воды, доводят рН до 7,5 +/- 0,1 соляной кислотой,
затем доводят общий объем раствора до 1 л.
5М NaCl - 292,5 г NaCl + H2O до 1 л.
Нейтрализующий буфер 2
x
(2 SSC + 50mM ЭДТА + 25mM калийфосфатный буфер рН 7,0):
x
20 SSC - 50 мл
0,5М ЭДТА - 50 мл
1М калийфосфатный буфер рН 7,0 - 12,5 мл
H2O - до 500 мл
x
20 SSC:
NaCl - 175,5 г
цитрат натрия - 88,3 г
H2O - до 1 л.
Для приготовления 1М калийфосфатного буфера рН 7,0 смешивают 61
мл 1М К2НРО4 (34,8 г/200 мл воды) с 39 мл K2HPO4 (27,2 г/200 мл воды)
и проверяют рН с помощью рН-метра, подводя к 7,0 добавлением одного
или другого раствора.
0,5М ЭДТА:
к 93 г ЭДТА-Na2 добавляют 300 - 350 мл подогретой
дистиллированной воды и постепенно приливают концентрированный раствор
NaOH до полного растворения и далее до рН 7,5 +/- 0,1. Общий объем
доводят водой до 500,0 мл.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".