Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".
7.4. Метод идентификации кукурузы линии MON 810,
устойчивой к стеблевому мотыльку [3]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя
раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - TAT CTC CAC TGA CGT AAG GGA TGA C
2 - TGC CCT ATA ACA CCA ACA TGT GCT T.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 9.
Таблица 9
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 10.
Таблица 10
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|------------------------------|--------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | 45 с/95 град.C |
| | 50 с/60 град.C |
| | 50 с/72 град.C |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов | 35 |
|амплификации | |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCTC
4 - GCA TTC AGA GAA ACG TGG CAG TAA C.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 11.
Таблица 11
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной| 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации
после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 12.
Таблица 12
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|---------------------------|-----------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Амплификация | 45 с/95 град.C |
| | 50 с/60 град.C |
| | 50 с/72 град.C |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Количество циклов | 40 |
|амплификации | |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 149 пар нуклеотидов, Прилож. 4.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".