Страницы: 1 2
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.
МЕТОДИКА
ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РФ
6 марта 2004 г.
N МУК 4.2.1902-04
(Д)
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения
с момента утверждения
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян -
руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, О.В. Анисимова);
Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И. Петухов);
Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н. Беляев,
И.В. Брагина, Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова, Т.Ф. Авдеенко, С.Ю.
Терехова, М.В. Зароченцев); Центром госсанэпиднадзора в г. Москве
(Н.Н. Филатов, И.И. Пискарева, Н.Я. Салова, Е.В. Сизых); Московской
медицинской академией им. Сеченова Минздрава России (Б.П. Суханов);
Центром "Биоинженерия" РАН (К.Г. Скрябин, Д.Б. Дорохов, Б.Б. Кузнецов,
Ю.Е. Асадова); МГУ прикладной биотехнологии Минобразования России
(И.А. Рогов, Н.Г. Кроха, А.Ф. Валихов).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации и введены в действие 06.03.04.
3. Введены впервые.
1. Введение
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методы
идентификации ГМИ растительного происхождения в пищевой продукции.
1.2. Методические указания предназначены для применения в
лабораториях учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской
Федерации, осуществляющей контроль за качеством продовольственного
сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую
Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических
заключений, в лабораториях других организаций, аккредитованных в
установленном порядке на право проведения контроля безопасности
пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3. Методические указания являются обязательными при контроле
пищевых продуктов на наличие генетически модифицированных источников и
применяются на этапах поставки на производство, гигиенической
экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза в страну и
реализации.
1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения
единого методического подхода для идентификации генетически
модифицированных источников в пищевых продуктах, продовольственном
сырье, пищевых и биологически активных добавках к пище.
2. Область применения
Методические указания содержат описание методов определения ГМИ
растительного происхождения в пищевых продуктах, основанных на
идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода полимеразной
цепной реакции (ПЦР). Описаны скрининговые методы, направленные на
выявление регуляторных последовательностей: промотора 35S из вируса
мозаики цветной капусты и терминатора NOS из Agrobactetium
tumefaciens. Идентификация этих регуляторных последовательностей
позволяет проводить предварительную проверку пищевой продукции на
наличие ГМИ, но не определяет примененную генетическую конструкцию или
конкретную линию растения (трансформационное событие), а также не
может применяться при проведении количественного анализа содержания
ГМИ. Окончательная идентификация ГМИ, разрешенных для реализации
населению и использования в пищевой промышленности в Российской
Федерации, проводится с применением протоколов исследований для
конкретных трансформационных событий, которые представляются
разработчиком в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России при
проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы. В Методических
указаниях описаны методы идентификации генетических конструкций для
наиболее часто встречаемых на мировом и внутреннем продовольственных
рынках генетически модифицированных растений.
Методы, применяемые при отборе проб пищевых продуктов, выделения
ДНК для проведения анализов, проведения электрофореза,
документирования и анализа получаемых данных, а также вопросы
организации рабочего места, являются обязательными к исполнению при
проведении как скрининговых, так и идентификационных анализов.
С целью выявления наличия сои и кукурузы как традиционных, так и
генно-модифицированных сортов в исследуемом пищевом продукте, а также
проверки качества выделяемых из исследуемых образцов препаратов ДНК
приведены методы идентификации последовательностей ДНК, специфичных
для всех линий сои и кукурузы.
Все представленные методы являются качественными и состоят из
следующих этапов: выделение ДНК из пищевого продукта, амплификация
целевой ДНК с соответствующими праймерами, электрофорез продуктов
амплификации в агарозном геле, документирование и анализ результатов.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты
Амплификатор типа "Терцик МС-2" со скоростью
нагрева/охлаждения активного элемента не менее
1,5 град.C/с
Прибор для горизонтального электрофореза типа
"Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет
и гребенок
Источник напряжения типа "Power Рас 300"
с диапазоном регулируемого напряжения
50 - 300 В
ТМ
Видеосистема типа "Gel Doc 2000 ",
предназначенная для ввода в компьютер,
анализа и документирования изображений
люминисцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных
бромистым этидием:
диапазон излучения 300 - 400 нм,
чувствительность - не менее 10 нг ДНК
(по бромистому этидию)
Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678
Камера морозильная, обеспечивающая температуру
минус 20 град.С
Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф
-1
(частота вращения не менее 13000 мин. )
Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа
Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон
температур от 15 до 120 град.С, количество гнезд -
не менее 20 каждого типа, точность поддержания
температуры - 0,2 град.С, разность температур
между соседними ячейками - не более 0,5 град.С
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс",
-1
скорость вращения 250 - 3000 мин.
Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W)
Весы лабораторные общего назначения
2-го класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г ГОСТ 24104
Анализатор потенциометрический, погрешность
измерений рН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Гомогенизатор перистальтического типа
"Стомайкер" или других моделей
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Дозаторы с переменным объемом дозирования:
0,2 - 2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 1,2%;
0,5 - 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 0,8%;
2 - 20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 0,8%;
20 - 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью
+/- 0,6%;
100 - 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью
+/- 3%;
2 - 10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью
+/- 0,5%
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с
техническими характеристиками не хуже указанных выше, отечественного и
зарубежного производства, разрешенных для применения в установленном
порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Колбы стеклянные мерные плоскодонные
конические вместимостью 25, 50, 100, 200,
1000 мл ГОСТ 12738-77
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные
вместимостью 25, 100, 1000 мл ГОСТ 1770-74
Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф
вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл
Наконечники с фильтром для дозаторов с
переменным объемом дозирования до:
10; 20; 200; 1000 куб. мм; 10 куб. см
3.3. Реактивы
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Кислота борная, хч ГОСТ 9656-75
Натрия гидроокись, чда ГОСТ 4328-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч ТУ 6-09-11-1721-83
Гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАВ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Н 5882
Трис (оксиметил) аминометан, хч ТУ 6-09-4292-76
Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N В 4287
Этидий бромистый, хч ТУ 6-09-13-452-75
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00
Спирт изопропиловый, хч ТУ 6-09-402-85
Масло вазелиновое медицинское ГОСТ 3164-78
Хлороформ, хч ГОСТ 20015-88
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Вода деионизированная ОСТ 11.029.003-80
2-меркаптоэтанол, хч ТУ 6-09-08-1024-81
Термостабильный фермент Taq-полимераза,
оптимум работы в области 70 - 72 град.С.
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 1806
Буфер для ПЦР с MgCl2.
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Р 2192
Агароза для электрофореза (тип П).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N А 6877
Маркер молекулярной массы ДНК.
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Р 1473
Стандартный образец состава генетически
немодифицированного источника пищи
растительного происхождения (Certified
Reference Material IRMM N 410R SB-0).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka),
кат. N 53198
Стандартный образец состава
генетически модифицированного источника пищи
растительного происхождения (Certified
Reference Material IRMM N 410R SB-5).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka),
кат. N 44386
Нуклеотиды:
- 2`-дезоксиаденозин-5`трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 4788
- 2`-дезоксицитидин-5`трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 4913
- 2`-дезоксигуанозин-5`трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 5038
- 2`-дезокситимидин-5`трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Т 9656
Праймеры на промотор 35S,
терминатор NOS, сою линии 40-3-2, кукурузу
линий MON 810 и Bt-176, ген cry III
(картофель), ген лектина (соя), ген зеина
(кукуруза). ЗАО "Синтол" (Россия)
http://www.syntol.ru
Допускается использование других реактивов с техническими
характеристиками не хуже указанных выше, препараты импортного
производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000
или EN 29000.
4. Подготовка к анализу
4.1. Приготовление растворов
Приготовление 1М Трис - HCl (рН 7,5)
В мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил)
аминометана (молекулярный вес 121) в 80 мл дистиллированной воды,
довести рН концентрированной соляной кислотой до 7,5, затем довести
объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при
температуре -20 ёC не более года.
Приготовление 5М NaCl
Растворить 29,22 г натрия хлористого (молекулярный вес 58,5) в
100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой
пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовление 30%-ной NaOH
Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярный вес 40) в 7 мл
дистиллированной воды.
Приготовление 0,5М ЭДТА (рН 8,0)
В мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г
этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 мл
дистиллированной воды. Раствором 30%-ной натрия гидроокиси довести рН
раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем раствора до метки,
перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной
температуре до 1 года.
Приготовленные растворы автоклавировать при 1 атм., 121 ёC 15 -
20 мин. или фильтровать через мембраны Millipore 0,4 мкм.
Приготовление хлороформа, насыщенного водой
Смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и
оставить на 24 ч для насыщения. Срок хранения при температуре от 4 до
5 град.С - не более 6 мес.
Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта
Смешать 70 мл 96%-ного этилового ректификованного спирта с 26 мл
деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 до 5 град.С
- не более 2 мес.
Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл)
Растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл
деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл
деионизированной воды.
Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20
град.С - не более 6 мес.
Приготовление лизирующего буфера (2%-ного "СТАВ")
Растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл
деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной
бане), добавить 2,5 мл 1М Трис - HCl, 7 мл 5М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА,
доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают.
Срок хранения при температуре от 4 до 5 град.С - не более 6 мес.,
допустимо образование осадка.
Перед использованием раствор выдерживают при комнатной
температуре или подогревают в термостате при температуре 65 град.С до
полного растворения осадка.
Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий
буфер вносят меркаптоэтанол из расчета 4 куб. мм на 1 куб. см
лизирующего буфера и перемешивают.
При проведении электрофореза использовать один из
нижеперечисленных буферов.
Приготовление 1x ТВЕ буфера для электрофореза
В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 г Трис (оксиметил)
аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной
кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до
полного растворения. Срок хранения 1x раствора - 10 дней, обычно
готовят 10x и перед употреблением разбавляют до 1x, используют
максимум три раза.
Приготовление 1x ТАЕ буфера для электрофореза
В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 242 г Трис-основания,
57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, долить
деионизованной водой до метки. Полученный 50x раствор перед
употреблением развести в 50 раз. Использовать для проведения
электрофореза не более двух раз.
Приготовление раствора бромистого этидия - C21H20N3Br (10 мг/мл)
Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды.
Срок хранения в посуде темного стекла - обязательно при температуре от
4 до 5 град.С - не более 12 мес.
Приготовление 2%-ного агарозного геля, см. п. 8
Допускается хранение готового геля в 1х буфере для электрофореза
в холодильнике при температуре от 4 до 5 град.С - не более 2 сут.
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам,
устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой
продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66,
13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312.1-84, 9792-73,
7631-85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88,
19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90,
15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02,
ГОСТ Р ИСО 2170-97.
6. Проведение анализа. Выделение ДНК
6.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ
(гексадецилтриметиламмониум бромид)
Подготовка пробы (раствора ДНК)
Навеску исследуемого продукта массой 70 - 80 мг поместить в
микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
Добавить 200 мкл лизирующего буфера с меркаптоэтанолом, тщательно
растереть пробу в пробирке пестиком.
Добавить еще 600 мкл лизирующего буфера с меркаптоэтанолом,
перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".
Инкубировать при 65 град.C 40 - 60 мин., перемешать на аппарате
для встряхивания, центрифугировать 7 мин. на настольной
микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 13000 об./мин.
Перенести супернатант в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл.
Добавить 400 мкл хлороформа, предварительно насыщенного водой.
Перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до
образования суспензии.
Центрифугировать 7 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию
хлороформом повторить.
Центрифугировать 7 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа.
Добавить 600 мкл изопропилового спирта, взятого из морозильной
камеры (минус 20 град.C), перемешать.
Поместить пробирку в морозильную камеру (минус 20 град.C) на 30
мин., не менее. В морозильной камере можно оставить на ночь.
Центрифугировать 6 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Тщательно удалить верхний слой.
Осадок промыть 200 мкл 70%-ного этилового спирта (2 - 3 раза),
каждый раз перемешивая на аппарате для встряхивания типа "Вортекс",
центрифугировать 6 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
(суспендированный в 70%-ном этаноле образец можно оставить на ночь в
морозильной камере при минус 20 град.C).
Последний раз тщательно до последней капли удалить спирт.
Подсушить осадок 5 мин. при 65 град.C для удаления капель спирта.
Растворить осадок в 50 - 100 мкл деионизированной воды, осторожно
встряхивая.
Полученный раствор ДНК готов для проведения ПЦР, хранить при
минус 20 град.C (допустимо неполное растворение осадка).
7. Амплификация
Общие требования к постановке идентификационной ПЦР.
При проведении идентификации ГМИ обязательно готовят следующие
пробы:
- ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к
соответствующей трансгенной конструкции;
- ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к специфичному
для вида пищевого продукта гену (лектин - для сои; зеин - для
кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к
соответствующей трансгенной конструкции;
- ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к специфичному
для вида пищевого продукта гену (лектин - для сои; зеин - для
кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- исследуемые образцы ДНК пищевого продукта с праймерами к
соответствующей трансгенной конструкции;
- исследуемые образцы ДНК пищевого продукта с праймерами к
специфичному для вида пищевого зерна гену (лектин - для сои; зеин -
для кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- безматричные контроли ПЦР для всех праймерных систем,
участвующих в анализе.
7.1. Метод идентификации промотора 35S [1]
Праймеры для идентификации промотора 35S:
1 - GCT CCT ACA AAT GCC ATC A
2 - GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 1.
Таблица 1
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
--------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 169 мкл | 338 мкл |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной| 29 мкл | 58 мкл |
| | цепной реакции с MgCl2| | |
| | (10x) | | |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 3 | Раствор БСА (20 | 29 мкл | 58 мкл |
| | мкг/мл) | | |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 4 | Смесь нуклеотидов | 14 мкл | 28 мкл |
| | (4 млМ) | | |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 7 | Taq-полимераза | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
| | (5 ед./мкл) | | |
--------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 2.
Таблица 2
----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
| |-------------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; | Trio |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4 | |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Денатурация |3 мин./94 гр.С |3 мин./94 гр.С |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Амплификация |20 с/94 гр.С |30 с/95 гр.С |
| |40 с/54 гр.С |40 с/54 гр.С |
| |60 с/72 гр.С |40 с/72 гр.С |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Количество циклов |40 |40 |
|амплификации | | |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 гр.С |3 мин./72 град.С|
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Фаза остывания |1 мин./4 гр.С |1 мин./4 град.С |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Скорость нагрева |0,77 гр.С/с |1 гр.С/с |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Скорость остывания |3,15 гр.С/с |1 гр.С/с |
----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В табл. 2 указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 195 пар нуклеотидов, Прилож. 1.
7.2. Метод идентификации терминатора NOS [1]
Праймеры для идентификации терминатора NOS:
1 - GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG
2 - TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 3.
Таблица 3
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 169 мкл | 338 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 29 мкл | 58 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29 мкл | 58 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14 мкл | 28 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 4.
Таблица 4
-----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
| |-------------------------------------------|
| |Gene Amp 2700; Био-Рад; | Trio |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4 | |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град.С |3 мин./94 град.С |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Амплификация |20 с/94 град.С |30 с/95 град.С |
| |40 с/54 град.С |40 с/54 град.С |
| |60 с/72 град.С |40 с/72 град.С |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Количество циклов |40 |40 |
|амплификации | | |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град.С |3 мин./72 град.С |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Фаза остывания |1 мин./4 град.С |1 мин./4 град.С |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Скорость нагрева |0,77 град.C/с |1 град.C/с |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Скорость остывания |3,15 град.C/с |1 град.C/с |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 180 пар нуклеотидов, Прилож. 2.
7.3. Метод идентификации сои линии 40-3-2,
устойчивой к глифосату [2]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя
раундами амплификации.
Первый раунд. Оба раунда проводятся в течение одного рабочего
дня.
Внешние праймеры:
1 - CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG
2 - CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 5.
Таблица 5
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|1 |Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|2 |Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| |реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|3 |Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|4 |Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|5 |Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|6 |Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 6.
Таблица 6
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|----------------------------|----------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМ-ПЛИ-4, Trio |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов | 25 |
|амплификации | |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA
4 - TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 7.
Таблица 7
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации
после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 8.
Таблица 8
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|-------------------------------|-------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Количество циклов амплификации | 35 |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 169 пар нуклеотидов, Прилож. 3.
7.4. Метод идентификации кукурузы линии MON 810,
устойчивой к стеблевому мотыльку [3]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя
раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - TAT CTC CAC TGA CGT AAG GGA TGA C
2 - TGC CCT ATA ACA CCA ACA TGT GCT T.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 9.
Таблица 9
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 10.
Таблица 10
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|------------------------------|--------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | 45 с/95 град.C |
| | 50 с/60 град.C |
| | 50 с/72 град.C |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов | 35 |
|амплификации | |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|------------------------------|--------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCTC
4 - GCA TTC AGA GAA ACG TGG CAG TAA C.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 11.
Таблица 11
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной| 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации
после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 12.
Таблица 12
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|---------------------------|-----------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Амплификация | 45 с/95 град.C |
| | 50 с/60 град.C |
| | 50 с/72 град.C |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Количество циклов | 40 |
|амплификации | |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|---------------------------|-----------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 149 пар нуклеотидов, Прилож. 4.
7.5. Метод идентификации кукурузы линии Bt-176,
устойчивой к стеблевому мотыльку [4]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя
раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - CGG CCC CGA GTT CAC CTT
2 - CTG CTG GGG ATG ATG TTG TTG.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 13.
Таблица 13
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 14.
Таблица 14
-----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
|-----------------------------|---------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|-----------------------------|---------------------------------------|
| Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|-----------------------------|---------------------------------------|
| Амплификация | 40 с/95 град.C |
| | 40 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|-----------------------------|---------------------------------------|
| Количество циклов | 25 |
| амплификации | |
|-----------------------------|---------------------------------------|
| Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|-----------------------------|---------------------------------------|
| Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
Страницы: 1 2 |