Страницы: 1 2
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - CCG CAC CCT GAG CAG CAC
4 - GGT GGC ACG TTG TTG TTC TGA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 15.
Таблица 15
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной| 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации
после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использования амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 16.
Таблица 16
----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
|---------------------------------|----------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|---------------------------------|----------------------------------|
| Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|---------------------------------|----------------------------------|
| Амплификация | 40 с/95 град.C |
| | 40 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|---------------------------------|----------------------------------|
| Количество циклов амплификации | 35 |
|---------------------------------|----------------------------------|
| Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|---------------------------------|----------------------------------|
| Фаза остывания | 4 град.C |
----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 189 пар нуклеотидов, Прилож. 5.
7.6. Идентификация картофеля, устойчивого
к колорадскому жуку (ген cry III A) [5]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя
раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC
2 - ATG CAC TCA CGT AGT CCT CC.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 17.
Таблица 17
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 161,3 мкл | 322,6 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 33 мкл | 66 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33 мкл | 66 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 мкл | 12,4 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 18.
Таблица 18
----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|-------------------------------|------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Денатурация | 2 мин./98 град.C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Количество циклов амплификации | 20 |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
1 - CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC
3 - TTG TAT AGA AGC TCA CGA GG.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 19.
Таблица 19
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 164,8 мкл | 329,6 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 33 мкл | 66 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33 мкл | 66 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 мкл | 12,4 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации
после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 20.
Таблица 20
-----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| | Gene Amp 2400; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Денатурация | 2 мин./98 град.C |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Количество циклов амплификации | 40 |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 102 пары нуклеотидов, Прилож. 6.
7.7. Идентификация ДНК сои: ген лектина [2]
Праймеры:
1 - GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C
2 - GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 21.
Таблица 21
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 22.
Таблица 22
----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
|----------------------------------|---------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, |
| | Trio |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Количество циклов амплификации | 40 |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Фаза остывания | 4 град.C |
----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 118 пар нуклеотидов, Прилож. 7.
7.8. Идентификация ДНК кукурузы: ген зеина [3]
Праймеры:
1 - TGC TTG CAT TGT TCG CTC TCC TAG
2 - GTC GCA GTG ACA TTG TGG CAT.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 23.
Таблица 23
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной| 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 24.
Таблица 24
----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
|--------------------------------|-----------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|--------------------------------|-----------------------------------|
| Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|--------------------------------|-----------------------------------|
| Амплификация | 1 мин./94 град.C |
| | 1 мин./60 град.C |
| | 1 мин./72 град.C |
|--------------------------------|-----------------------------------|
| Количество циклов амплификации | 40 |
|--------------------------------|-----------------------------------|
| Конечное удлинение | 7 мин./72 град.C |
|--------------------------------|-----------------------------------|
| Фаза остывания | 4 град.C |
----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 329 пар нуклеотидов, Прилож. 8.
7.9. Идентификация ДНК картофеля:
ген фосфоенолпируват карбоксилазы
Праймеры:
1 - GTC TCC TTG GCT CAT TTT ATG C
2 - CAA GTT AGC TGC CAT TCT GGC C.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 25.
Таблица 25
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|1 | Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|2 | Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 26.
Таблица 26
----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град. C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Амплификация | 1 мин./94 град. C |
| | 1 мин./60 град. C |
| | 1 мин./72 град. C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Количество циклов амплификации | 40 |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Конечное удлинение | 7 мин./72 град. C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град. C |
----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 1149 пар нуклеотидов.
8. Проведение электрофореза в агарозном геле
Приготовление агарозного геля
Для приготовления 2%-ной агарозы необходимо к 1 г агарозы
добавить 50 мл 1х буфера ТВЕ и тщательно перемешать.
Полученный раствор поместить в микроволновую печь (на 2 - 5 мин.,
в зависимости от мощности печи следить за интенсивностью кипения
суспензии!) или прокипятить на водяной бане 15 мин. до полного
растворения агарозы.
Расплавленную агарозу охладить до 56 град.С и добавить 5 мкл
бромистого этидия (концентрация 10 мг/мл), тщательно перемешать.
Расплавленную агарозу с бромистым этидием разлить в
подготовленную форму. Толщина геля 0,5 - 0,7 см.
Через 30 - 40 мин. удалить гребенку. Готовый гель можно
использовать сразу, можно хранить в 1х буфере в холодильнике при 4
град.С.
Проведение электрофореза
Смешать в отдельной пробирке 2 мкл буфера для нанесения и 10 мкл
реакционной смеси. Внести смесь в лунки геля. (Можно использовать
соотношение буфер/реакционная смесь - 2/8.) В одну из лунок (чаще в
крайнюю) внести маркер молекулярной массы (можно 100 Вр).
Поместить заполненный гель в камеру для электрофореза,
заполненную буфером 1х ТБЕ. Толщина слоя буфера над поверхностью геля
примерно 2 - 3 мм.
В режиме постоянного напряжения 100 V электрофорез длится
примерно 70 - 90 мин.
Гель (без формы) поместить на фильтр трансиллюминатора и
посмотреть в проходящем ультрафиолетовом свете.
Документировать результат фореза либо на фотопленку "Микрат
Изопан" (изопанхроматическая фотопленка чувствительностью 3 ед. ГОСТ,
фотографическая широта 10, разрешение - 300 линий/мм), либо при помощи
гельдокументирующей системы. Фотокопия геля должна быть приложена к
отчету по идентификации (при цифровой съемке - распечатывается на
принтере с разрешением не менее 300 dpi).
9. Источники появления ложных положительных сигналов
при проведении ПЦР-диагностики и их предотвращение [6]
Наиболее мощные источники загрязнений (в порядке вклада):
- загрязнение продуктами предыдущих реакций;
- плазмиды, фаги, космиды и прочие векторы, особенно если они
используются в качестве зондов при гибридизации;
- положительный контроль (клонированная ДНК или сырье);
- перекрестное загрязнение образцов;
- загрязнение из других источников при взятии образцов (возможно
даже загрязнение от перчаток);
- загрязнение препарата полимеразы бактериальной ДНК (важно при
получении ПЦР продуктов консервативных областей генов 16S рРНК, к
примеру).
--------------------------------------------------------------------
| Стадии анализа | Источники загрязнений |
|---------------------------------|--------------------------------|
| Окружающая | Источник | Ошибки при выборе источника |
| среда | материала | |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Сбор образцов | Посуда, шпатели, перчатки |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Фиксация | Загрязненные реактивы для фикса|
| | образцов | |
|---------------------------------|--------------------------------|
| Транспортирование | Техника, резервуары |
| образцов | |
|---------------------------------|--------------------------------|
| Лаборатория | Приготовление | Ошибки персонала, загрязнение |
| | образцов | положительным контролем (матери|
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Выделение ДНК | Загрязнения продуктами предыдущ|
| | | ПЦР |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Постановка ПЦР | Положительные контроли, векторы|
| | | реактивы |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Анализ | Ошибки персонала |
| | продуктов ПЦР | |
--------------------------------------------------------------------
Применение более чувствительных методик проведения ПЦР (таких как
Hot-Start, nested-PCR) существенно повышает чувствительность ПЦР к
посторонним загрязнениям.
Следует отметить, что хотя большинство причин ложных
положительных сигналов (ЛПС) являются следствием внутрилабораторных
причин, не стоит сбрасывать со счетов и загрязнения, происходящие вне
лаборатории во время сбора образцов, их первичной обработки (фасовка,
упаковка, транспортирование), поскольку именно на этой стадии наиболее
сложно обеспечить стерильные условия работы.
Для повышения точности анализа необходимо постоянно использовать
в работе отрицательные контроли, эксперименты должны выполняться не
менее чем в двух повторностях (исследовать от одного образца продукта
сразу две пробы). В случае получения постоянных положительных сигналов
на отрицательных контролях все исходные реактивы подлежат немедленной
замене.
Возможные причины возникновения ЛПС, не связанные с внешними
источниками:
- наличие амплифицируемой ДНК при проведении ПЦР с обратной
транскрипцией (важно при определении вироида и РНК-содержащих
вирусов);
- амплифицирование сходных последовательностей, с которыми
связываются праймеры, - псевдогенов и гомологов (здесь важен этап
конструирования праймеров);
- неспецифическая амплификация (правильный подбор условий
проведения ПЦР).
Предотвращение появления ложно положительных сигналов (ЛПС)
1. Этапы приема, регистрации проб и выделения ДНК, приготовление
реакционных смесей и амплификации, детекции продуктов амплификации
должны размещаться в разных помещениях. Выделение ДНК и приготовление
реакционных смесей следует проводить в ПЦР-боксах.
2. Приготовление реакционных смесей для проведения ПЦР (без
ДНК-матриц), т.н. "master-mix" следует готовить в отдельном помещении.
Подготовка ПЦР-смесей при массовом анализе проводится либо в начале
рабочего дня тем персоналом, который в дальнейшем будет проводить
обработку образцов и выделение ДНК, либо отдельными людьми, в чью
задачу входит только приготовление "master-mix" (второе
предпочтительнее). В любом случае помещение для подготовки
"master-mix" должно быть оборудовано отдельными наборами пипеток,
необходимой посудой, стерильными перчатками, лабораторной одеждой и
обувью, а также морозильниками для хранения основных запасов
олигонуклеотидов, термополимеразы, буферов и трифосфатов,
предварительно разлитыми на отдельные аликвоты объемом не более
недельной потребности.
3. Планирование проведения анализа должно предусматривать
минимизацию ручной обработки реакционных смесей.
4. Вскрытие пробирок с продуктами ПЦР разрешается только в
пост-ПЦР помещении. Запрещается выход персонала из пост-ПЦР помещений
в лабораторной одежде и перенос отработанных материалов (одноразового
пластика, гелей, перчаток, буферных растворов, мелкого лабораторного
оборудования - электрофоретических камер, лабораторного стекла (колбы
для плавления агарозы), автоматических пипеток и пр.) без тщательной
упаковки в герметичные пластиковые мешки. Это относится и к случаям
перемещения оборудования для проведения необходимого ремонта или
замены.
Правила работы для персонала
1. Работы на этапе детекции продуктов амплификации проводят
сотрудники, не занятые на других этапах ПЦР-исследований.
2. На каждом этапе ПЦР-исследования необходимо использовать
индивидуальный набор соответствующего лабораторного оборудования,
расходных материалов и одежды. Одноразовые перчатки подлежат смене при
каждой новой операции. Работа без перчаток запрещена.
3. Запрещается перемещать личные вещи, лабораторные журналы,
лабораторную одежду и канцелярские принадлежности между зонами
лаборатории.
Работа с оборудованием
1. Мини-центрифуги, вортексы, штативы для пробирок,
автоматические пипетки, термостаты и маркерные карандаши являются
принадлежностями определенного рабочего места и перемещению с места на
место не подлежат.
2. Агарозные и полиакриламидные гели должны быть собраны в
закрывающиеся контейнеры для дальнейшей утилизации.
3. Сменные наконечники для пипеток и полипропиленовые пробирки
разрешается использовать только из заводской упаковки.
Автоклавирование одноразового пластика не производится.
4. Для того, чтобы избежать аэрозольного загрязнения пипеток,
использовать только наконечники с антиаэрозольными барьерными
вставками.
Работа с реактивами
1. Серийные аликвоты реагентов должны быть пронумерованы и
занесены в специальный журнал с указанием номера партии реактивов, из
которой произведено аликвотирование, даты приготовления аликвот и
лица, производившего разлив реагентов.
2. Перед работой с ДНК или перед переносом приготовленных к
проведению реакции ПЦР-смесей все исходные реагенты должны быть убраны
в морозильную камеру, предназначенную для рабочих реактивов.
Запрещается возвращать частично использованные реактивы в холодильник
для хранения аликвот, равно как и в холодильник для хранения исходных
растворов в промышленных упаковках.
3. Степень рабочего разведения для каждого типа положительного
контроля определяется отдельно. Одновременно запрещается готовить
разведения положительных и отрицательных контролей на одном и том же
рабочем месте. При добавлении ДНК в готовые реакционные смеси первым
следует добавлять отрицательный контроль (контроли), далее -
исследуемый материал, а положительный контроль - в последнюю очередь.
10. Организация рабочих мест
А. Общие требования
1. Исследования по идентификации ГМИ растительного происхождения
могут проводиться на базе лабораторий, проводящих исследования методом
ПЦР с патогенными биологическими агентами. В таком случае должно быть
предусмотрено лишь разграничение исследований во времени. При
организации исследований по идентификации ГМИ необходимо предусмотреть
наличие вспомогательных помещений (комнаты ведения учетной
документации; раздевалки для сотрудников, комнаты приема пищи,
туалеты, подсобные помещения), которые могут быть общими с другими
подразделениями учреждения. Курение и прием пищи на рабочих местах
строго запрещены. Для приема пищи выделяется отдельное помещение, вход
в которое в лабораторной одежде запрещено.
2. Для сотрудников лаборатории должна быть предусмотрена
спецодежда: медицинский халат, шапочка, перчатки и сменная обувь. При
работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать
бахилы.
3. Пробирки с продуктами ПЦР и использованные наконечники к
микродозаторам подвергаются первичной обработке растворами,
вызывающими деградацию ДНК.
4. По окончании работ обрабатывают рабочие поверхности
растворами, вызывающими деградацию ДНК (например, 0,2%-ный раствор
ДП-2Т или аналогичный ему). Перед началом работ рабочую поверхность
столов дополнительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Ежемесячно
проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов и
штативов 1N соляной кислотой.
Во всех помещениях лаборатории ежедневно должна проводиться
влажная уборка. Для каждого этапа проведения исследований должен быть
выделен индивидуальный набор уборочного инвентаря. Уборочный инвентарь
запрещается использовать для уборки других помещений.
Нормативные ссылки
1. Федеральный закон N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом
благополучии населения" от 30 марта 1999 г.
2. Федеральный закон N 2-ФЗ "О внесении изменений и дополнений в
Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" и Кодекс РСФСР
об административных правонарушениях" от 9 января 1996 г. (ред. от
30.12.01).
3. Федеральный закон N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых
продуктов" от 02.01.00.
4. Федеральный закон N 86-ФЗ "О государственном регулировании в
области генно-инженерной деятельности" от 05.06.96 (ред. от 12.07.00).
5. Федеральный закон N 96-ФЗ "О внесении изменений и дополнений в
Федеральный закон о государственном регулировании в области
генно-инженерной деятельности" от 21.06.00.
6. "Основы законодательства Российской Федерации об охране
здоровья граждан" от 22 июля 1993 г. N 5487-1 (ред. от 30.06.03).
7. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом
нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской
Федерации N 554 от 24.07.00.
8. Положение о Государственной санитарно-эпидемиологической
службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства
Российской Федерации N 554 от 24.07.00.
9. Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации N 7 от 6 апреля 1999 г. "О порядке гигиенической
оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически
модифицированных источников".
10. Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации N 149 от 16.09.03 "О проведении
микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически
модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых
продуктов".
11. Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности
пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01.
12. Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации от 08.11.00 N 14 "О порядке проведения
санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной
из генетически модифицированных источников".
13. Приказ N 325 МЗ РФ от 15.08.01 (ред. от 18.03.02) "О
санитарно-эпидемиологической экспертизе продукции" (зарегистрированный
в МЮ РФ 19.10.01, N 2978).
Библиографические данные
1. Lipp M., Brodman P. Pietsch et al IUPAC Collaborative Trial
Study of a Method to detect Genetically Modified Soy Beans and Maize
in Dried Powder // Journal of AOAC International, 1999. V. 82. N 4. P.
923 - 929.
2. Meyer R., Jaccaud E. Detection of genetically modified soya in
processed food products: development and validation of a PCR assay for
the specific detection of Glyphosate-Tolerant Soybeans. Proceedings of
the EURO FOOD CHEM IX Conference, Interlaken, Switzerland, 1997 /
Event N 220 (1). H. 23 - 28.
3. Zimmermann A., Liniger M., Luthy J. Еt al а sensitive
detection method for genetically modified MaisGard TM corn using a
nested-PCR system. Lebensm.-Wiss.U.-Technol. 1998. N 31. P. 664 - 667.
4. Studer E., Dahinden I., Luthy J., Hubner P. Nachweis des
gentechnisch veranderten "Maximizer" Mais mittels der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) // Mitteilungen aus dem Gebiet der
Lebensmittel und Hygiene. 1997, 88, 515 - 524.
5. Jaccaud E., Honne M., Meyer R. Assessment of Screening Methods
for the Identification of Genetically Modified Potatoes in Raw
Materials and Finished Progucts // J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 550
- 557.
6. Yap E.P.H., Lo Y.-M.O., K.A. Fleming, McGee J.O`D.
False-positives and Contamination in PCR. In: PCR Technology, Current
Innovations. Ed.G. Griffin, A.M. Griffin, CRC Press, 1994.
Приложение 1
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ
ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК (МИШЕНЬ - ПРОМОТОР 35S),
ПРОДУКТ ПЦР - 195 ПАР НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои линии
40-3-2 (содержит промотор 35S)
2 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из концентрата
белка семян сои линии 40-3-2 (содержит промотор 35S)
3 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из изолята белка
семян сои линии 40-3-2 (содержит промотор 35S)
4 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои
5 - Обязательной контроль качества реакционной смеси - ПЦР в
отсутствие матричной ДНК
6 - Маркер молекулярной массы ДНК
Приложение 2
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ
ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК (МИШЕНЬ - ТЕРМИНАТОР NOS),
ПРОДУКТ ПЦР - 180 ПАР НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои линии
40-3-2 (содержит терминатор NOS)
2 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из концентрата
белка семян сои линии 40-3-2 (содержит терминатор NOS)
3 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из изолята белка
семян сои линии 40-3-2 (содержит терминатор NOS)
4 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои
5 - Обязательный контроль качества реакционной смеси - ПЦР в
отсутствие матричной ДНК
6 - Маркер молекулярной массы
Приложение 3
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК,
ХАРАКТЕРНОЙ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ СОИ ЛИНИИ 40-3-2,
ОПРЕДЕЛЯЮЩЕЙ УСТОЙЧИВОСТЬ К ГЛИФОСАТУ, ПРОДУКТ
ПЦР - 169 ПАР НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - Маркер молекулярной массы
2 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои
3 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои линии
40-3-2
4 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из концентрата
белка семян сои линии 40-3-2
Приложение 4
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК,
ХАРАКТЕРНОЙ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ КУКУРУЗЫ ЛИНИИ
MON 810, УСТОЙЧИВОЙ К СТЕБЛЕВОМУ МОТЫЛЬКУ,
ПРОДУКТ ПЦР - 149 ПАР НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной кукурузы
2 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из кукурузы линии
MON 810
3 - Маркер молекулярной массы
4 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из кукурузы линии
MON 810
Приложение 5
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ
ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, ХАРАКТЕРНОЙ ДЛЯ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ КУКУРУЗЫ ЛИНИИ BT-176,
ПРОДУКТ ПЦР - 189 ПАР НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - Маркер молекулярной массы
2 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из кукурузы линии
Bt-176
3 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной кукурузы
Приложение 6
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК,
ХАРАКТЕРНОЙ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ КАРТОФЕЛЯ,
УСТОЙЧИВОГО К КОЛОРАДСКОМУ ЖУКУ, ПРОДУКТ
ПЦР - 102 ПАРЫ НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - 4, 6, 7 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из
сортов картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (ген cry III A)
5 - Маркер молекулярной массы
8 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из клубней
нетрансгенного картофеля
Приложение 7
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК СОИ (ГЕН ЛЕКТИН),
ПРОДУКТ ПЦР - 118 ПАР НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - Маркер молекулярной массы
2 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои
3 - Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК
4 - 7 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из продуктов
переработки сои
Приложение 8
(обязательное)
ПРИМЕР ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДАННЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК КУКУРУЗЫ (ГЕН ЗЕИН),
ПРОДУКТ ПЦР - 329 ПАР НУКЛЕОТИДОВ <*>
------------------------------------
<*> Фото не приводится.
1 - Маркер молекулярной массы
2 - 5 - Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной кукурузы
6 - Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК
Приложение 9
(необязательное)
СХЕМА ИДЕНТИФИКАЦИИ ГМИ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
----------------------------------------------------------------------
| ------------- |
| |Отсутствует| |
| ----------------- Определение ГМИ ------------- |
| |Пищевой продукт|-----------------------------------| |
| ----------------- -------|------ |
| |Присутствует| |
| -------------- |
| Идентификация ГМИ | |
| ----------------------------------------------| |
| ------|-------- ------------------- --------|----------|
| |Разрешен для | |Не прошел систему| | Запрещен ||
| |пищевых целей| | регистрации | |для пищевых целей||
| --------------- ------------------- -------------------|
| | |
| | --------------------- |
| ------|--------- --------|Подлежит маркировке| |
| |Количественное| | --------------------- |
| | определение |-------------| |
| ---------------- | ------------------------ |
| --------|Не подлежит маркировке| |
| ------------------------ |
----------------------------------------------------------------------
Приложение 10
(необязательное)
МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК С ПРИМЕНЕНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ WIZARD,
PROMEGA С ПРИМЕНЕНИЕМ НАБОРА РЕАКТИВОВ PROMEGA
Подготовка пробы (раствора ДНК)
Навеску исследуемого продукта массой 150 - 200 мг поместить в
микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
Добавить 300 мкл буфера I, тщательно растереть пробу в пробирке
пестиком до гомогенного состояния.
Добавить 500 мкл буфера II, перемешать на аппарате для
встряхивания типа "Вортекс".
Инкубировать при 65 град.C 40 - 60 мин., перемешать на аппарате
для встряхивания, охладить до комнатной температуры.
Добавить 500 мкл буфера III, перемешать на аппарате для
встряхивания типа "Вортекс" в течение 2 мин.
Центрифугировать 7 мин. на настольной микроцентрифуге типа
Эппендорф при частоте вращения 13000 об./мин.
Перенести 1000 мкл супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл.
Добавить 500 мкл смолы Wizard MaxiPreps.
Перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".
При помощи стерильного шприца емкостью 2 мл прокачать смесь через
микроцентрифужную колонку.
Новым стерильным шприцем емкостью 2 мл прокачать через
микроцентрифужную колонку 2 мл промывочного буфера.
Поместить микроколонку в микроцентрифужную пробирку типа
Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
Центрифугировать 1 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Поместить микроколонку в чистую микроцентрифужную пробирку типа
Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
Добавить в колонку 100 мкл деионизованной воды.
Центрифугировать 1 мин. при частоте вращения 12000 об./мин.
Полученный раствор ДНК готов для проведения ПЦР, хранить при
минус 20 град.C.Страницы: 1 2 |