Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".
7.3. Метод идентификации сои линии 40-3-2,
устойчивой к глифосату [2]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя
раундами амплификации.
Первый раунд. Оба раунда проводятся в течение одного рабочего
дня.
Внешние праймеры:
1 - CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG
2 - CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 5.
Таблица 5
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|1 |Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|2 |Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| |реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|3 |Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|4 |Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|5 |Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
|6 |Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 6.
Таблица 6
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|----------------------------|----------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМ-ПЛИ-4, Trio |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов | 25 |
|амплификации | |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|----------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA
4 - TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 7.
Таблица 7
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 25 мкл | 50 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации
после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 8.
Таблица 8
-----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|-------------------------------|-------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Денатурация | 3 мин./95 град.C |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Количество циклов амплификации | 35 |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|-------------------------------|-------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 169 пар нуклеотидов, Прилож. 3.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".