МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.. Методика. Главный государственный санитарный врач РФ. 06.03.04 МУК 4.2.1902-04

7.2. Метод идентификации терминатора NOS [1]

     Праймеры для идентификации терминатора NOS:
     1 - GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG
     2 - TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA.
     Реакционная  смесь  для  проведения  полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 3.

                                                             Таблица 3

     В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:

----------------------------------------------------------------------
| N  | Реактивы                      | Объем          | Объем        |
| п/п|                               | реакционной    | реакционной  |
|    |                               | смеси 25 мкл   | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1  | Деионизированная вода         |    169 мкл     | 338 мкл      |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2  | Буфер для полимеразной цепной |    29 мкл      | 58 мкл       |
|    | реакции с MgCl2 (10x)         |                |              |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3  | Раствор БСА (20 мкг/мл)       |    29 мкл      | 58 мкл       |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4  | Смесь нуклеотидов (4 млМ)     |    14 мкл      | 28 мкл       |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5  | Праймер 1 (20 мкМ)            |    7 мкл       | 14 мкл       |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6  | Праймер 2 (20 мкМ)            |    7 мкл       | 14 мкл       |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 7  | Taq-полимераза (5 ед./мкл)    |    1,5 мкл     | 3,0 мкл      |
----------------------------------------------------------------------

     Примечание.  Реакционную  смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.

     Подготовка к проведению амплификации
     Реакционную  смесь  разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
     В  каждую  пробирку  с  24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
     Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
     При  использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
     Условия амплификации представлены в табл. 4.

                                                             Таблица 4

-----------------------------------------------------------------------
|         Стадия          |         Тип амплификатора <*>             |
|                         |-------------------------------------------|
|                         |Gene Amp 2700; Био-Рад; |    Trio          |
|                         |  Терцик МС-2, АМПЛИ-4  |                  |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Денатурация              |3 мин./94 град.С        |3 мин./94 град.С  |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Амплификация             |20 с/94 град.С          |30 с/95 град.С    |
|                         |40 с/54 град.С          |40 с/54 град.С    |
|                         |60 с/72 град.С          |40 с/72 град.С    |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Количество циклов        |40                      |40                |
|амплификации             |                        |                  |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Конечное удлинение       |3 мин./72 град.С        |3 мин./72 град.С  |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Фаза остывания           |1 мин./4 град.С         |1 мин./4 град.С   |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Скорость нагрева         |0,77 град.C/с           |1 град.C/с        |
|-------------------------|------------------------|------------------|
|Скорость остывания       |3,15 град.C/с           |1 град.C/с        |
-----------------------------------------------------------------------

------------------------------------
     <*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания.  Для  других  амплификаторов  необходимо  подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.

     После   проведения   амплификации  пробы  готовы  для  проведения
электрофореза в агарозном геле.
     Схема проведения электрофореза, п. 8.
     Продукт амплификации - 180 пар нуклеотидов, Прилож. 2.