МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.. Методика. Главный государственный санитарный врач РФ. 06.03.04 МУК 4.2.1902-04

7.1. Метод идентификации промотора 35S [1]

     Праймеры для идентификации промотора 35S:
     1 - GCT CCT ACA AAT GCC ATC A
     2 - GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA.
     Реакционная  смесь  для  проведения  полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 1.

                                                             Таблица 1

     В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:

--------------------------------------------------------------
| N  | Реактивы              | Объем          | Объем        |
| п/п|                       | реакционной    | реакционной  |
|    |                       | смеси 25 мкл   | смеси 50 мкл |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 1  | Деионизированная вода | 169 мкл        | 338 мкл      |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 2  | Буфер для полимеразной| 29 мкл         | 58 мкл       |
|    | цепной реакции с MgCl2|                |              |
|    | (10x)                 |                |              |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 3  | Раствор БСА (20       | 29 мкл         | 58 мкл       |
|    | мкг/мл)               |                |              |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 4  | Смесь нуклеотидов     | 14 мкл         | 28 мкл       |
|    | (4 млМ)               |                |              |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 5  | Праймер 1 (20 мкМ)    | 7 мкл          | 14 мкл       |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 6  | Праймер 2 (20 мкМ)    | 7 мкл          | 14 мкл       |
|----|-----------------------|----------------|--------------|
| 7  | Taq-полимераза        | 1,5 мкл        | 3,0 мкл      |
|    | (5 ед./мкл)           |                |              |
--------------------------------------------------------------

     Примечание.  Реакционную  смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.

     Подготовка к проведению амплификации
     Реакционную  смесь  разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
     В  каждую  пробирку  с  24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
     Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
     При  использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
     Условия амплификации представлены в табл. 2.

                                                             Таблица 2

----------------------------------------------------------------------
|         Стадия         |          Тип амплификатора <*>            |
|                        |-------------------------------------------|
|                        | Gene Amp 2700; Био-Рад;  |    Trio        |
|                        |   Терцик МС-2, АМПЛИ-4   |                |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Денатурация             |3 мин./94 гр.С            |3 мин./94 гр.С  |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Амплификация            |20 с/94 гр.С              |30 с/95 гр.С    |
|                        |40 с/54 гр.С              |40 с/54 гр.С    |
|                        |60 с/72 гр.С              |40 с/72 гр.С    |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Количество циклов       |40                        |40              |
|амплификации            |                          |                |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Конечное удлинение      |3 мин./72 гр.С            |3 мин./72 град.С|
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Фаза остывания          |1 мин./4 гр.С             |1 мин./4 град.С |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Скорость нагрева        |0,77 гр.С/с               |1 гр.С/с        |
|------------------------|--------------------------|----------------|
|Скорость остывания      |3,15 гр.С/с               |1 гр.С/с        |
----------------------------------------------------------------------

------------------------------------
     <*> В табл. 2 указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания.  Для  других  амплификаторов  необходимо  подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.

     После   проведения   амплификации  пробы  готовы  для  проведения
электрофореза в агарозном геле.
     Схема проведения электрофореза, п. 8.
     Продукт амплификации - 195 пар нуклеотидов, Прилож. 1.