Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".
7.6. Идентификация картофеля, устойчивого
к колорадскому жуку (ген cry III A) [5]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя
раундами амплификации.
Первый раунд.
Внешние праймеры:
1 - CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC
2 - ATG CAC TCA CGT AGT CCT CC.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 17.
Таблица 17
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 161,3 мкл | 322,6 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 33 мкл | 66 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33 мкл | 66 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 мкл | 12,4 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 18.
Таблица 18
----------------------------------------------------------------------
|Стадия | Тип амплификатора <*> |
|-------------------------------|------------------------------------|
| | Gene Amp 2700; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Денатурация | 2 мин./98 град.C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Количество циклов амплификации | 20 |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|-------------------------------|------------------------------------|
|Фаза остывания | 4 град.C |
----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
1 - CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC
3 - TTG TAT AGA AGC TCA CGA GG.
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 19.
Таблица 19
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
----------------------------------------------------------------------
| N | Реактивы | Объем | Объем |
| п/п| | реакционной | реакционной |
| | | смеси 25 мкл | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1 | Деионизированная вода | 164,8 мкл | 329,6 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2 | Буфер для полимеразной цепной | 33 мкл | 66 мкл |
| | реакции с MgCl2 (10x) | | |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33 мкл | 66 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4 | Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 мкл | 12,4 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
----------------------------------------------------------------------
Примечание. Реакционную смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации
после 1-го раунда.
Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 20.
Таблица 20
-----------------------------------------------------------------------
| Стадия | Тип амплификатора <*> |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| | Gene Amp 2400; Био-Рад; |
| | Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Денатурация | 2 мин./98 град.C |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Амплификация | 30 с/95 град.C |
| | 30 с/60 град.C |
| | 40 с/72 град.C |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Количество циклов амплификации | 40 |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Конечное удлинение | 3 мин./72 град.C |
|---------------------------------|-----------------------------------|
| Фаза остывания | 4 град.C |
-----------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
Схема проведения электрофореза, п. 8.
Продукт амплификации - 102 пары нуклеотидов, Прилож. 6.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".