МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.. Методика. Главный государственный санитарный врач РФ. 06.03.04 МУК 4.2.1902-04

7.7. Идентификация ДНК сои: ген лектина [2]

     Праймеры:
     1 - GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C
     2 - GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG.
     Реакционная  смесь  для  проведения  полимеразной цепной реакции,
рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 21.

                                                            Таблица 21

     В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:

----------------------------------------------------------------------
| N  | Реактивы                      | Объем          | Объем        |
| п/п|                               | реакционной    | реакционной  |
|    |                               | смеси 25 мкл   | смеси 50 мкл |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 1  | Деионизированная вода         |  193,7 мкл     | 387,5 мкл    |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 2  | Буфер для полимеразной цепной |  25 мкл        | 50 мкл       |
|    | реакции с MgCl2 (10x)         |                |              |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 3  | Смесь нуклеотидов (4 млМ)     |  12,5 мкл      | 25 мкл       |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 4  | Праймер 1 (20 мкМ)            |  6,25 мкл      | 12,5 мкл     |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 5  | Праймер 2 (20 мкМ)            |  6,25 мкл      | 12,5 мкл     |
|----|-------------------------------|----------------|--------------|
| 6  | Taq-полимераза (5 ед./мкл)    |  1,3 мкл       | 2,5 мкл      |
----------------------------------------------------------------------

     Примечание.  Реакционную  смесь готовят на необходимое количество
проб, но не меньше чем на 5.

     Подготовка к проведению амплификации
     Приготовленные   реакционные   смеси  перемешать  на  вортексе  и
центрифугировать 30 с при 3000 об./мин.
     Реакционную  смесь  разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0
мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в
каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
     В  каждую  пробирку  с  24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в
каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
     Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин.).
     При  использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую
пробирку добавить каплю минерального масла.
     Условия амплификации представлены в табл. 22.

                                                            Таблица 22

----------------------------------------------------------------------
| Стадия                           | Тип амплификатора <*>           |
|----------------------------------|---------------------------------|
|                                  | Gene Amp 2700; Био-Рад;         |
|                                  | Терцик МС-2, АМПЛИ-4,           |
|                                  | Trio                            |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Денатурация                      | 3 мин./95 град.C                |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Амплификация                     | 30 с/95 град.C                  |
|                                  | 30 с/60 град.C                  |
|                                  | 40 с/72 град.C                  |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Количество циклов амплификации   | 40                              |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Конечное удлинение               | 3 мин./72 град.C                |
|----------------------------------|---------------------------------|
| Фаза остывания                   | 4 град.C                        |
----------------------------------------------------------------------

------------------------------------
     <*> В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились
испытания.  Для  других  амплификаторов  необходимо  подбирать условия
проведения амплификации индивидуально.

     После проведения амплификации пробы поместить на холод.
     Хранение  не  более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда.
     После   проведения   амплификации  пробы  готовы  для  проведения
электрофореза в агарозном геле.
     Схема проведения электрофореза, п. 8.
     Продукт амплификации - 118 пар нуклеотидов, Прилож. 7.