Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".
9. Источники появления ложных положительных сигналов
при проведении ПЦР-диагностики и их предотвращение [6]
Наиболее мощные источники загрязнений (в порядке вклада):
- загрязнение продуктами предыдущих реакций;
- плазмиды, фаги, космиды и прочие векторы, особенно если они
используются в качестве зондов при гибридизации;
- положительный контроль (клонированная ДНК или сырье);
- перекрестное загрязнение образцов;
- загрязнение из других источников при взятии образцов (возможно
даже загрязнение от перчаток);
- загрязнение препарата полимеразы бактериальной ДНК (важно при
получении ПЦР продуктов консервативных областей генов 16S рРНК, к
примеру).
--------------------------------------------------------------------
| Стадии анализа | Источники загрязнений |
|---------------------------------|--------------------------------|
| Окружающая | Источник | Ошибки при выборе источника |
| среда | материала | |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Сбор образцов | Посуда, шпатели, перчатки |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Фиксация | Загрязненные реактивы для фикса|
| | образцов | |
|---------------------------------|--------------------------------|
| Транспортирование | Техника, резервуары |
| образцов | |
|---------------------------------|--------------------------------|
| Лаборатория | Приготовление | Ошибки персонала, загрязнение |
| | образцов | положительным контролем (матери|
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Выделение ДНК | Загрязнения продуктами предыдущ|
| | | ПЦР |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Постановка ПЦР | Положительные контроли, векторы|
| | | реактивы |
|---------------|-----------------|--------------------------------|
| | Анализ | Ошибки персонала |
| | продуктов ПЦР | |
--------------------------------------------------------------------
Применение более чувствительных методик проведения ПЦР (таких как
Hot-Start, nested-PCR) существенно повышает чувствительность ПЦР к
посторонним загрязнениям.
Следует отметить, что хотя большинство причин ложных
положительных сигналов (ЛПС) являются следствием внутрилабораторных
причин, не стоит сбрасывать со счетов и загрязнения, происходящие вне
лаборатории во время сбора образцов, их первичной обработки (фасовка,
упаковка, транспортирование), поскольку именно на этой стадии наиболее
сложно обеспечить стерильные условия работы.
Для повышения точности анализа необходимо постоянно использовать
в работе отрицательные контроли, эксперименты должны выполняться не
менее чем в двух повторностях (исследовать от одного образца продукта
сразу две пробы). В случае получения постоянных положительных сигналов
на отрицательных контролях все исходные реактивы подлежат немедленной
замене.
Возможные причины возникновения ЛПС, не связанные с внешними
источниками:
- наличие амплифицируемой ДНК при проведении ПЦР с обратной
транскрипцией (важно при определении вироида и РНК-содержащих
вирусов);
- амплифицирование сходных последовательностей, с которыми
связываются праймеры, - псевдогенов и гомологов (здесь важен этап
конструирования праймеров);
- неспецифическая амплификация (правильный подбор условий
проведения ПЦР).
Предотвращение появления ложно положительных сигналов (ЛПС)
1. Этапы приема, регистрации проб и выделения ДНК, приготовление
реакционных смесей и амплификации, детекции продуктов амплификации
должны размещаться в разных помещениях. Выделение ДНК и приготовление
реакционных смесей следует проводить в ПЦР-боксах.
2. Приготовление реакционных смесей для проведения ПЦР (без
ДНК-матриц), т.н. "master-mix" следует готовить в отдельном помещении.
Подготовка ПЦР-смесей при массовом анализе проводится либо в начале
рабочего дня тем персоналом, который в дальнейшем будет проводить
обработку образцов и выделение ДНК, либо отдельными людьми, в чью
задачу входит только приготовление "master-mix" (второе
предпочтительнее). В любом случае помещение для подготовки
"master-mix" должно быть оборудовано отдельными наборами пипеток,
необходимой посудой, стерильными перчатками, лабораторной одеждой и
обувью, а также морозильниками для хранения основных запасов
олигонуклеотидов, термополимеразы, буферов и трифосфатов,
предварительно разлитыми на отдельные аликвоты объемом не более
недельной потребности.
3. Планирование проведения анализа должно предусматривать
минимизацию ручной обработки реакционных смесей.
4. Вскрытие пробирок с продуктами ПЦР разрешается только в
пост-ПЦР помещении. Запрещается выход персонала из пост-ПЦР помещений
в лабораторной одежде и перенос отработанных материалов (одноразового
пластика, гелей, перчаток, буферных растворов, мелкого лабораторного
оборудования - электрофоретических камер, лабораторного стекла (колбы
для плавления агарозы), автоматических пипеток и пр.) без тщательной
упаковки в герметичные пластиковые мешки. Это относится и к случаям
перемещения оборудования для проведения необходимого ремонта или
замены.
Правила работы для персонала
1. Работы на этапе детекции продуктов амплификации проводят
сотрудники, не занятые на других этапах ПЦР-исследований.
2. На каждом этапе ПЦР-исследования необходимо использовать
индивидуальный набор соответствующего лабораторного оборудования,
расходных материалов и одежды. Одноразовые перчатки подлежат смене при
каждой новой операции. Работа без перчаток запрещена.
3. Запрещается перемещать личные вещи, лабораторные журналы,
лабораторную одежду и канцелярские принадлежности между зонами
лаборатории.
Работа с оборудованием
1. Мини-центрифуги, вортексы, штативы для пробирок,
автоматические пипетки, термостаты и маркерные карандаши являются
принадлежностями определенного рабочего места и перемещению с места на
место не подлежат.
2. Агарозные и полиакриламидные гели должны быть собраны в
закрывающиеся контейнеры для дальнейшей утилизации.
3. Сменные наконечники для пипеток и полипропиленовые пробирки
разрешается использовать только из заводской упаковки.
Автоклавирование одноразового пластика не производится.
4. Для того, чтобы избежать аэрозольного загрязнения пипеток,
использовать только наконечники с антиаэрозольными барьерными
вставками.
Работа с реактивами
1. Серийные аликвоты реагентов должны быть пронумерованы и
занесены в специальный журнал с указанием номера партии реактивов, из
которой произведено аликвотирование, даты приготовления аликвот и
лица, производившего разлив реагентов.
2. Перед работой с ДНК или перед переносом приготовленных к
проведению реакции ПЦР-смесей все исходные реагенты должны быть убраны
в морозильную камеру, предназначенную для рабочих реактивов.
Запрещается возвращать частично использованные реактивы в холодильник
для хранения аликвот, равно как и в холодильник для хранения исходных
растворов в промышленных упаковках.
3. Степень рабочего разведения для каждого типа положительного
контроля определяется отдельно. Одновременно запрещается готовить
разведения положительных и отрицательных контролей на одном и том же
рабочем месте. При добавлении ДНК в готовые реакционные смеси первым
следует добавлять отрицательный контроль (контроли), далее -
исследуемый материал, а положительный контроль - в последнюю очередь.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.".