Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".
5.3. Идентификация культур холерных вибрионов
Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью
определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей
серогруппы (O1, O139 или др.).
К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные,
полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с
одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу,
ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты
(без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но не активные в
отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим
субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не
обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают
нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое
положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от
родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.
------------------------
|Семейство Vibrionaceae|
|Shewan and Veron, 1965|
------------------------
|---------------------
\/ |
------------------------ |
| Типовой род Vibrio | |
| Pacini, 1854 | |
------------------------ \/
--------------------- | | ----------------------
|36 видов вибрионов,|<------ | |Другие роды: |
|в т.ч. патогенных | \/ |Aeromonas Kluyver et|
|для человека: | ----------------- |Van Niel, 1936; |
|V. alginolyticus | | Типовой вид | |Enhydrobacter Staley|
|V. cincinnatiensis | |Vibrio cholerae| |et al, l987; |
|V. damsela <**> | ----------------- |Photobacterium |
|V. fluvialis | | |Beijerinc, 1889; |
|V. furnissii | | |Plesiomonas Habs et |
|V. harveyi | \/ |Schubert, 1962 |
|V. hollisae | ----------------- L---------------------
|V. metschnikovii | | Серогруппы |
|V. mimicus | -----------------
|V. parahaemolyticus| | | |
|V. vulnificus | | | |
--------------------- | | |
--------------- \/ ---------
--------- | --------- | ---------
| O1 |<- | O139 | ->| non |
| |--------------| | |O1/O139|
--------- | --------- ---------
| \/ |
| Возбудители холеры Возбудители | гастроэнтеритов
| и системных | инфекций
\/ \/
------------------ ------------------------
| Биовары | |V. cholerae O2 - O138,|
------------------ |O140 - O190... |
----- ------------ |(по международной |
| | |классификации) |
\/ \/ |V. cholerae O2 - O83 |
V. cholerae V. cholerae |(по отечественной |
cholerae eltor |классификации) <***> |
| | ------------------------
---- ------
\/ \/
------------------
| Серовары: |
| Inaba |
| Ogava |
| Hikojima |
------------------
Рис. 2. Классификация вибрионов <*>
------------------------------------
<*> Таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of
Determinative Bacteriology, 1994.
<**> Предложено McDonell & Colwell (1985) отнести к новому роду
Listonella.
<***> Типовые штаммы О2 - О39 соответствуют Sakazaki (1970); О40
- О83, а также O12; О23 и О26 не изучены в сравнении с международной
коллекцией типовых штаммов.
Таблица 2
ОСНОВНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ РОДА VIBRIO
И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Признаки |Роды сем. Vibrionaceae |Enterobacteriaceae|Pseudomonadaceae|
| |-------------------------------------------------------------------| | |
| |Vibrio |Aeromonas|Enhydrobacter|Plesiomonas|Photobacterium| | |
| |----------------| | | | | | |
| |V. |другие | | | | | | |
| |cholerae|виды | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9 |
|----------------------|-------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Окраска по |Грамотрицательные |
|Граму, |полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки |
|морфология | |
|----------------------|-------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Подвижность |+ |+(-) |+(-) |- |+ |+ |+(-) |+ |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Оксидаза |+ |+(-) |+ |+ |+ |+(-) |- |+(-) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Рост на средах |+ |-(+) |+ |+ |+ |- |- |- |
|без NaCl | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Чувствительность |+ |+(-) |- |- |+ |+ |- |- |
|к О129 <*> | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|О/Ф глюкозы |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/+ |+/- |
|в среде | | | | | | | | |
|Хью - Лейфсона | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Газ из глюкозы |- |-(+) |+(-) |- |- |+ |+/- |- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Лизиндекарбоксилаза |+ |+(-) |-(+) |+ |+ |+ |+/- |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Орнитиндекарбоксилаза |+ |+/- |-(+) |+ |+ |+ |+/- |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Аргининдигидролаза |- |-(+) |+ |+ |+ |+ |-/+ |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Ферментация: | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|лактозы |- |-(+) |-(+) |- |+ |X |+/- |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|маннита |+ |+(-) |+(-) |X |- |- |+(-) |+(-) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|арабинозы |- |-(+) |+(-) |X |- |- |+(-) |-(+) |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|сахарозы |+ |+(-) |+ |X |- |-(+) |+/- |- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|инозита |- |-(+) |- |X |+ |- |-(+) |X |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Образование: | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|ацетилметилкарбинола |+(-) |-(+) |+(-) |- |- |+ |-(+) |X |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|индола |+ |+(-) |+(-) |- |- |- |+(-) |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|нитратредуктазы |+ |+(-) |+ |+ |+ |+(-) |+ |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|бета-галактозидазы |+ |+(-) |+ |X |+ |+ |-(+) |X |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|желатиназы |+ |+(-) |+ |X |- |+ |-(+) |+/- |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Биолюминесценц |-(+) |-(+) |- |X |- |+ |- |- |
|ия | | | | | | | | |
|----------------------|--------|-------|---------|-------------|-----------|--------------|------------------|----------------|
|Мол. % G + C |38 |51 |57 - |66 |51 |40 - |39 - |58 - |
|в ДНК | | |63 | | |44 |59 |70 |
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------
<*> Бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидин.
Условные обозначения:
Х - нет данных;
+ - положительный результат в 90%;
- - отрицательный результат в 90%;
+/- - положительный и отрицательный результаты встречаются в
равной степени;
+(-) или -(+) - в скобках редко наблюдаемый результат.
Таблица 3
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ
РОДА VIBRIO
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|Признаки |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |V. |
| |cholerae|alginolyticus|cicinnatiensis|damsela|fluvialis|furnissii|harveyi|hollisae|metschnikovii|mimicus|parahaemolyticus|vulnificus|
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9 |10 |11 |12 |13 |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Морфология | | | | | | | | | | | | |
|<*> |+ |+ |+ |d |d |+ |- |+/- |d |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Подвижность | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Роение на |- |+ |- |- |- |- |d |- |- |- |d |- |
|агаре | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Индофенолоксидаза |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Образование: | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|газа из глюкозы |- |- |- |- |- |+ |- |- |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|индола |+ |+ |- |- |- |+(-) |+ |+ |+(-) |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|ацетилметилкарбинола |+(-) |+ |+/- |+ |- |- |d |- |+ |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Ферментация: | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|лактозы |- |- |- |- |- |- |- |- |+(-) |-(+) |- |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|арабинозы |- |- |+ |- |+ |+ |- |+ |- |-(+) |+/- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|сахарозы |+ |+ |+ |- |+ |+ |d |- |+ |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|целлобиозы |- |- |+ |- |- (+) |- (+) |d |- |- |- |- |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|маннита |+ |+ |- |- |+ |+ |d |- |+ |+ |+ |+(-) |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|салицина |- |- |+ |- |+/- |- |- |- |- |- |- |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Аргининдигидролаза |- |- |- |+ |+ |+ |- |- |-(+) |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Лизиндекарбосилаза |+ |+ |+ |+(-) |- |- |+ |- |+(-) |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Орнитиндекарбоксилаза|+ |d |- |- |- |- |- |- |- |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|бета-галактозидаза |+ |- |+/- |- |d |d |- |- |d |+ |- |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Нитратредуктаза |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Амилаза |+ |+ |+ |X |+ |d |+ |X |+ |- |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Желатиназа |d |+ |- |- |+/- |d |- |- |d |d |+ |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Рост в 1%-ной | | | | | | | | | | | | |
|пептонной | | | | | | | | | | | | |
|воде | | | | | | | | | | | | |
|с NaCL: |+ |- |- |- |- (+) |- (+) |- |- |-(+) |+ |- |- |
|0% | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|3% |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |-(+) |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|6% |d |+ |+ |+ |+ |+ |+ |d |d |d |+ |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|10% |- |+ |- |- |- (+) |- |- |- |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Рост при: | | | | | | | | | | | | |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|4 ёC |- |- |- |- |- |- |- |X |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|20 ёC |+ |+ |- |- |+ |+ |+ |X |+ |X |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|35 ёC |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |X |+ |+ |+ |+ |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|42 ёC |+ |+ |- |- |d |- |d |X |d |d |d |d |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|45 ёC |- |- |- |- |d |- |- |X |d |X |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Биолюминесценция |-(+) |- |- |- |- |- |d |- |- |- |- |- |
|---------------------|--------|-------------|--------------|-------|---------|---------|-------|--------|-------------|-------|----------------|----------|
|Чувствительность |+ |-(+) |-(+) |+ |d |- |+ |d |+ |+ |-(+) |+ |
|к О129 | | | | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------
<*> Грамотрицательные прямые или изогнутые палочки.
Условные обозначения: см. обозначения табл. 2;
d - различный результат.
Таблица 4
ОТНОШЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ К ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИМ УГЛЕВОДАМ
----------------------------------------------------------------
|Виды |Ферментация |
|вибрионов |------------------------------------------|
| |арабинозы |маннозы |сахарозы |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. cholerae |- |+(-) |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. mimicus |- |+ |- |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. metschnikovii |- |+/- |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. fluvialis |+ |+ |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. vulnificus |- |+(-) |-(+) |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. alginolyticus |- |+ |+ |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. |+(-) |+ |-(+) |
|parahaemolyticus | | | |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. hollisae |+ |-(+) |- |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. furnissii |+ |+(-) |+ |
| |с образованием газа |
|-------------------|------------------------------------------|
|V. damsela |- |+ |- |
| |с образованием газа у некоторых штаммов |
|-------------------|------------------------------------------|
|V. |+ |X |+ |
|cincinnatiensis | | | |
|-------------------|-------------|---------------|------------|
|V. harveyi |- |X |+(-) |
----------------------------------------------------------------
Условные обозначения:
() - в скобках указан редко встречающийся вариант;
+/- - приблизительно 50% штаммов не обладают этими признаками;
X - нет данных.
Возбудителями холеры являются V. cholerae O1 (биоваров
классического и эльтор; сероваров Инаба, Огава или Гикошима) и O139
серогрупп.
Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов O1
и O139 серогрупп, содержащие гены холерного токсина (ctx АВ) и
токсинкорегулируемых пилей (tcp А), вызывают заболевания холерой,
склонные к широкому эпидемическому распространению.
Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина),
эпидемически не опасные варианты холерных вибрионов O1 и других
серогрупп могут вызывать спорадические или групповые (при общем
источнике инфицирования) заболевания, не склонные к широкому
эпидемическому распространению.
Предварительную идентификацию проводят по комплексу признаков,
включая морфологию колоний, морфологию и подвижность микробных клеток,
пробу на оксидазу и слайд-агглютинацию с сыворотками O1 (1:50 -
1:100), РО (1:50) и O139 (в разведении, соответствующем обозначению на
этикетке). Для культур, положительно реагирующих с сывороткой O1,
устанавливают принадлежность к серологическим вариантам (Инаба и
Огава) также в слайд-агглютинации.
Окончательную идентификацию выделенных на полиуглеводной среде
или щелочном агаре агглютинирующихся на стекле культур проводят по
сокращенной или полной схеме.
Сокращенная схема предусматривает изучение культуры в развернутой
реакции агглютинации с холерными сыворотками O1, Инаба, Огава и РО,
определение чувствительности к диагностическим бактериофагам
классическому и эльтор, отношения к глюкозе в среде Хью - Лейфсона,
сахарозе, маннозе, манниту и арабинозе в средах Гисса. Культуры
оксидазопозитивных, активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу
в среде Хью - Лейфсона до кислоты без газа, ферментирующие сахарозу,
маннозу, маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе,
агглютинирующиеся не менее чем до 1/2 титра сыворотками O1 и одной из
варианто-специфических сывороток, относят к V. cholerae O1 серовара
Огава или Инаба. Культуры, агглютинирующиеся обеими
варианто-специфическими сыворотками не менее чем до 1/2 титра, относят
к серовару Гикошима. В случае агглютинабельности выделенной культуры
обеими варианто-специфическими сыворотками целесообразно повторить
исследование с использованием различных серий коммерческих препаратов.
Для подтверждения выделенной культуры холерных вибрионов к O139
серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с
соответствующей сывороткой.
Полная схема идентификации культур, агглютинирующихся холерными
сыворотками O1 серогруппы, предусматривает изучение их по
дополнительным тестам, определяющим принадлежность к биовару
(гемагглютинация, чувствительность к полимиксину, биовароспецифическим
фагам, реакция Фогес - Проскауэра), определение антибиотикограммы и
эпидемической значимости по чувствительности к ctx+ и ctx- фагам в
сочетании с тестом Грейга на гемолиз, а в специализированных
учреждениях кроме того - по результатам исследования в ПЦР, методом
молекулярного зондирования на наличие гена холерного токсина и
определения холерогенности на модели кроликов-сосунков.
В случае выделения культур холерных вибрионов O139 серогруппы их
также изучают по чувствительности к антибиотикам, определяют
эпидемическую значимость ориентировочно по гемолитической активности в
пробе Грейга, окончательно - указанными выше специальными методами.
На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические,
культуральные и биохимические признаки, агглютинирующиеся O1 и одной
из варианто-специфических сывороток не менее чем до 1/2 титра,
лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами, а также на
культуры, агглютинирующиеся сывороткой O139, выдают окончательный
ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и определяя
эпидемическую значимость по результатам ориентировочных или
специальных исследований.
Токсигенные штаммы холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, как
правило, не лизируют эритроциты барана, в отличие от нетоксигенных
штаммов.
Кроме того, для холерных вибрионов O1 серогруппы указывают биовар
на основании чувствительности к одному из диагностических фагов
(эльтор или классическому) и (или) по дополнительным признакам для
фагорезистентных культур (табл. 5).
Таблица 5
ПРИЗНАКИ, ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ БИОВАРЫ V. CHOLERAE O1
---------------------------------------------------------------
|Признаки |Биовары |
| |--------------------------|
| |V. cholerae | V. cholerae|
| |eltor | cholerae |
|----------------------------------|-------------|------------|
|Лизабельность холерными фагами: | | |
|----------------------------------|-------------|------------|
|классическим |- | + |
|----------------------------------|-------------|------------|
|эльтор |+/- | -(+) |
|----------------------------------|-------------|------------|
|Чувствительность к 50 ед./мл |-(+) | + |
|полимиксина В | | |
|----------------------------------|-------------|------------|
|Агглютинация куриных эритроцитов |+(-) | - |
|----------------------------------|-------------|------------|
|Образование ацетилметилкарбинола |+(-) | - |
---------------------------------------------------------------
Культуры, имеющие признаки вибрионов по морфологии колоний и
клеток, тесту на индофенолоксидазу и ферментативной активности на
полиуглеводной среде, не агглютинирующиеся на стекле холерными
сыворотками O1 и O139 серогрупп, выделенные от больных острыми
кишечными инфекциями, идентифицируют по тестам, определяющим
принадлежность к роду Vibrio и виду V. cholerae (табл. 2 и 3).
Принадлежащие к V. cholerae культуры изучают в пробе с
диагностическими фагами. При выделении чувствительных к холерным
диагностическим монофагам, но не агглютинирующихся холерными
сыворотками O1 культур, особое значение имеет изучение их клеточного
состава, т.к. в популяции таких штаммов могут находиться типичные
холерные вибрионы O1 серогруппы. Если культура по совокупности
признаков относится к виду холерных вибрионов, ее изучают в реакции
агглютинации с набором диагностических холерных сывороток О2 - О83
серогрупп по отечественной классификации (рис. 2).
На культуры, агглютинирующиеся одной из сывороток, выдают ответ о
выделении V. cholerae О2, O5 или другой серогруппы.
Если культуры не типируются указанными холерными сыворотками или
они отсутствуют в лаборатории, то выделенную культуру обозначают
обобщенно - V. cholerae не O1/O139 серогрупп.
Кроме этого, штаммы V. cholerae non O1 типируют бактериофагами
диагностическими холерными ТЭПВ 1 - 7.
Энтеропатогенные холерные вибрионы не O1 группы относятся
преимущественно к О2, О5, О6, О8, O9, O14, O17, О22, О24, О28, О34,
O36, О41, О42, О47 и О50 серогруппам и, как правило, лизируются фагами
ТЭПВ 1, 4, 7.
У выделенных от больных штаммов холерных вибрионов не O1/O139
серогрупп определяют антибиотикограмму. Для выделенных из окружающей
среды вибрионов, не агглютинирущихся холерными O1 и O139 сыворотками,
целесообразность полной таксономической характеристики определяется в
каждом случае отдельно для конкретных территорий и объектов с учетом
эпидситуации по холере и регистрации острых кишечных заболеваний,
обусловленных этими микроорганизмами.
Идентификация атипичных культур холерных вибрионов.
К атипичным относят культуры холерных вибрионов, отклоняющиеся от
типичных по отдельным родовым и видовым признакам, а также по
агглютинабельности группо- и варианто-специфическими сыворотками O1 и
чувствительности к диагностическим фагам (классическому и эльтор).
Антигенная изменчивость холерных вибрионов O1 может выражаться в
ослаблении до 1/4 титра или утрате агглютинабельности холерными
сыворотками O1, Инаба, Огава. Встречаются штаммы, агглютинирующиеся
только холерной сывороткой O1 серогруппы и не реагирующие с
варианто-специфическими сыворотками (Инаба и Огава), что делает
невозможным установление их серовара. В случае S-R диссоциации
культуры холерных вибрионов начинают агглютинироваться РО-сывороткой.
При этом в одних случаях штаммы агглютинируются всеми холерными
сыворотками, в т.ч. и РО, их обозначают как SR-варианты, в других -
измененные холерные вибрионы в диагностических титрах агглютинируются
только с РО-сывороткой и не агглютинируются холерными сыворотками O1,
Инаба и Огава, их относят к R-вариантам.
В последние годы возросла частота встречаемости резистентных к
диагностическим холерным фагам штаммов среди холерных вибрионов O1,
выделяемых как от людей, так и из объектов окружающей среды.
При этом фагоустойчивость вибрионов, снижение или отсутствие
агглютинабельности холерными сыворотками иногда сочетается с
вариабельностью по другим признакам (культурально-морфологическим и
биохимическим). Штаммы, атипичные по морфологическим признакам,
образуют шероховатые, слизистые, мутные и пигментированные колонии.
Размер их также может варьировать, вплоть до появления едва видимых
карликовых колоний. У таких культур нередко снижена подвижность,
наблюдается спонтанная агглютинация в 0,9-процентном растворе натрия
хлорида. Отмечена возможность обнаружения в организме больного и в
воде открытых водоемов холерных вибрионов в Л-форме. В мазках,
сделанных из атипичных культур холерных вибрионов, клетки имеют форму
шаров, сферопластов, встречаются вытянутые, извитые, неделящиеся
клетки в виде цепей или нитей.
Нередко встречаются штаммы, измененные по биохимическим
свойствам, у которых отмечается ослабление, замедление или утрата
способности расщеплять углеводы и многоатомные спирты (крахмал,
маннит, маннозу, сахарозу), аминокислоты (триптофан, лизин, орнитин) и
другие субстраты.
Во всех случаях выделения атипичных культур обязательно изучение
их по признакам, определяющим их принадлежность к роду Vibrio и виду
Vibrio cholerae (определение типа расщепления глюкозы в среде Хью и
Лейфсона, декарбоксилаз лизина и орнитина и дигидролазы аргинина,
чувствительности к вибриостатику O129 -
2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидину и др.).
Атипичные культуры холерных вибрионов, обладающие указанными выше
признаками рода Vibrio и вида Vibrio cholerae, агглютинирующиеся
сывороткой O1 до 1/4 титра, лизирующиеся и не лизирующиеся
диагностическими монофагами до ДРТ, следует относить к серогруппе O1.
Для всестороннего изучения все атипичные культуры холерных
вибрионов следует направлять в специализированные лаборатории.
Для подтверждения принадлежности к V. cholerae O1 слабо
агглютинирующихся (ниже 1/4 титра), диссоциирующих и фагорезистентных
культур обязательным является использование высокочувствительных
методов (ПЦР со специфическими праймерами) и, по возможности, реакции
агглютинации с кроличьими холерными сыворотками, обладающими большей
специфичностью, чем лошадиные, поскольку они не содержат пула
неспецифических иммуноглобулинов.
Рекомендуется при изучении измененных по антигенной структуре
культур использовать также такие методы, как РНГА, РНАт,
иммунофлюоресценцию, преципитацию в геле, адсорбцию агглютининов по
Кастеллани, реакцию агглютинации с убитыми кипячением культурами,
пробу с комплементом, позволяющую отбирать из популяции измененных
штаммов типичные, резистентные к нему клоны в S-форме.
При получении сомнительных результатов слайд-агглютинации с
холерной сывороткой O139 серогруппы следует повторить исследование с
нагретой культурой.
Для серологической идентификации спонтанно агглютинирующихся
культур применяют те же методы и дополнительно реакцию агглютинации с
использованием осажденной культуры и 0,3-процентного раствора натрия
хлорида для разведения диагностических сывороток и приготовления
взвеси изучаемой культуры.
Ускоренная идентификация культур.
Обнаруженные на III - IV этапах исследования материала от
больного подозрительные на холерный вибрион колонии или сплошной рост
чистой культуры на щелочном агаре отсевают в 3 мл питательного
бульона. Спустя 3 ч инкубации при (37 +/- 1) ёC из бульонной культуры
делают мазки для окраски по Граму и препараты для постановки феномена
иммобилизации с сыворотками O1 и O139 серогрупп, а также для
исследования прямым и непрямым иммунофлюоресцентным методом.
При положительных результатах иммобилизации и иммунофлюоресценции
с сывороткой O1 серогруппы изучение проводят по тестам:
- агглютинабельности сыворотками O1, Инаба и Огава,
раститрованными двукратно в 1-процентной пептонной воде до титра;
- чувствительности к холерным диагностическим фагам
(классическому и эльтор);
- ферментации глюкозы, маннозы, сахарозы и арабинозы в
тест-наборах или средах Гисса в объеме 1 мл с учетом результатов через
3 - 6 ч инкубации при температуре (37 +/- 1) ёC;
- чувствительности к антибиотикам;
- на присутствие генов патогенности с помощью ПЦР.
При положительных результатах иммунофлюоресценции (непрямой
вариант) и иммобилизации сывороткой O139 серогруппы проводят
определение биохимической активности, антибиотикограммы методом
дисков, токсигенности в ПЦР.
Во всех случаях параллельно обязательно делают высев на щелочной
агар для выделения чистой культуры и последующей идентификации ее по
полной схеме.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".