О НАДЗОРЕ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГМО
ПОСТАНОВЛЕНИЕ
ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РФ
30 ноября 2007 г.
N 80
(Д)
Я, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко, проанализировав материалы государственного надзора за
выполнением обязательных требований при обороте пищевых продуктов,
содержащих компоненты, полученные с применением генно - инженерно -
модифицированных организмов (далее - ГМО), отмечаю.
В Российской Федерации с 1996 года разработана и функционирует
законодательная, нормативная и методическая база, позволяющая
осуществлять оценку безопасности, и организован мониторинг за оборотом
пищевой продукции, полученной из ГМО. Действующая система в
значительной степени гармонизирована с требованиями международных
организаций и Европейского союза.
За период с 1996 по 2007 год в мире площади посевов генетически
модифицированных культур возросли в 60 раз, достигнув более 110 млн.
га. В настоящее время разрешено к применению в разных странах более
120 видов трансгенных растений, в том числе 86 - в Европе.
В Российской Федерации за эти годы прошли полный цикл
исследований 17 видов генетически модифицированных культур. На
30.11.2007 на территории Российской Федерации действуют
санитарно-эпидемиологические заключения и свидетельства о
государственной регистрации на 12 видов пищевой продукции
растительного происхождения, полученных с применением трансгенных
технологий: 6 сортов кукурузы, 4 сорта картофеля, 1 сорт риса и 1 сорт
сахарной свеклы.
В мире существуют разные подходы к этикетированию пищевых
продуктов, полученных из ГМО. В США, Канаде, Аргентине данные продукты
не этикетируются, в странах ЕЭС принят 0,9% пороговый уровень, в
странах Японии, Австралии - 5%. При этом введение порогового уровня
содержания ГМО, при котором необходимо этикетировать пищевые продукты,
не связано с вопросом их безопасности, а преследует цели
информирования населения об использовании технологии получения пищевых
продуктов.
С 12 декабря 2007 года вступает в силу Федеральный закон от
25.10.2007 N 234-ФЗ "О внесении изменений в Закон Российской Федерации
"О защите прав потребителей" и часть вторую Гражданского кодекса
Российской Федерации" (Собрание законодательства Российской Федерации,
2007, N 44, ст. 5282), в котором подпунктом а) пункта 3 статьи 1 в
абзац третий пункта 2 статьи 10 Закона Российской Федерации от
07.02.1992 N 2300-1 "О защите прав потребителей" (Собрание
законодательства Российской Федерации, 1996, N 3, ст. 140) внесено
дополнение об обязательном наличии в отношении продуктов питания
информации о наличии в них компонентов, полученных с ГМО, в случае,
если содержание указанных организмов в таком компоненте составляет
более 0,9%.
Таким образом, с учетом объективной необходимости определения
порядка соответствующего этикетирования пищевых продуктов, полученных
из ГМО, как формы реализации права потребителя на своевременное
получение необходимой и достоверной информации о составе пищевых
продуктов, обеспечивающей возможность их правильного выбора, Закон
Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 "О защите прав
потребителей" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1996, N
3, ст. 140) был гармонизирован с требованиями Европейского союза по
этикетированию пищевых продуктов, полученных из ГМО, установленными
Директивой Европейского Парламента и Совета от 22.09.2003 N 1829/2003
о генетически модифицированной пище и кормах, которая с апреля 2004 г.
ввела в странах Европейского союза 0,9% пороговый уровень для
этикетирования пищевых продуктов, полученных из ГМО.
Ранее аналогичный показатель был закреплен санитарно -
эпидемиологическими правилами СанПиН 2.3.2.2227-07 "Дополнения и
изменения N 5 к санитарно-эпидемиологическим правилам СанПиН
2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой
ценности пищевых продуктов" (зарегистрированы в Минюсте России
16.06.2007, регистрационный номер 9852), установившими с 01.09.2007,
что содержание в пищевых продуктах 0,9% и менее компонентов,
полученных с применением ГМО, является случайной или технически
неустранимой примесью и пищевые продукты, содержащие указанное
количество таких компонентов, не относятся к категории пищевых
продуктов, содержащих компоненты, полученные с применением ГМО.
Система оценки безопасности пищевых продуктов, полученных из ГМО,
включает проведение пострегистрационного мониторинга за ее оборотом,
для осуществления которого разработаны методы идентификации ГМО в
пищевых продуктах.
В системе Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации
имеется лабораторная база по исследованию пищевых продуктов на наличие
ГМО. Постановлением Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации от 31.12.2004 N 13 "Об усилении надзора за
пищевыми продуктами, полученными из ГМО" (по заключению Минюста России
от 18.02.2005 N 01/1203-ВЯ данное Постановление не нуждается в
государственной регистрации) определены головные центры по
количественному исследованию пищевых продуктов на наличие ГМО в каждом
федеральном округе.
За 9 месяцев 2007 г. учреждениями Роспотребнадзора на наличие
компонентов, полученных с применением ГМО, исследовано 29816 проб
(2006 г. - 37879, 2005 г. - 18872, 2004 г. - 12956, 2003 г. - 4300)
продовольственного сырья и пищевых продуктов. Из них компоненты ГМО
содержали 652 пробы (2006 г. - 1452, 2005 г. - 1443, 2004 г. - 1552,
2003 г. - 511), что составило 2,2% (2006 г. - 2,7%, 2005 г. - 7,6%,
2004 г. - 12%, 2003 г. - 11,9%). Наиболее часто ГМО встречаются в
мясных продуктах - 3,8% (2006 г. - 6,6%, 2005 г. - 15,8%, 2004 г. -
20,5%, 2003 г. - 14,8%), птицеводческих продуктах - 5,6% (2006 г. -
3,8%, 2005 г. - 9,1%, 2004 г. - 15,43%, 2003 г. - 29,5%), группе
продуктов "прочие" (в основном растительные белки) - 3,3% (2006 г. -
3,9%, 2005 г. - 10,8%, 2004 г. - 16,7%, 2003 г. - 16,4%). В 2007 г.
увеличилась доля содержания компонентов ГМО в молочных продуктах (9
месяцев 2007 г. - 5,1%, 2006 г. - 1,3%).
Учреждениями Роспотребнадзора при исследовании пищевых продуктов
количественным методом определения ГМО по предварительным данным
выявлено, что оборот пищевых продуктов, содержащих компоненты ГМО
более 0,9%, составляет менее 1% от оборота всех пищевых продуктов,
однако 90% из них не имеют обязательной информации о наличии ГМО.
В связи с вышеизложенным, с целью усиления госсанэпиднадзора за
пищевыми продуктами и в соответствии с Федеральным законом от
30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии
населения" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, N
14, ст. 1650; 2002, N 1 (ч. I), ст. 1; 2003, N 2, ст. 167; N 27 (ч.
I), ст. 2700; 2004, N 35, ст. 3607; 2005, N 19, ст. 1752; 2006, N 1,
ст. 10; 2006, N 52 (ч. I), ст. 5498; 2007, N 1 (ч. I), ст. 21; 2007, N
1 (ч. I), ст. 29; 2007, N 27, ст. 3213, 2007, N 46, ст. 5554) и
Федеральным законом от 01.01.2000 N 29-ФЗ "О качестве и безопасности
пищевых продуктов" (Собрание законодательства Российской Федерации,
2000, N 2, ст. 150; 2002, N 1 (ч. I), ст. 2; 2003, N 2, ст. 167, N 27
(ч. I), ст. 2700; 2004, N 35, ст. 3607; 2005, N 19, ст. 1752, N 50,
ст. 5242; 2006, N 1, ст. 10, N 14, ст. 1458) постановляю:
1. Организациям, осуществляющим ввоз, производство и оборот
пищевых продуктов, принять меры по обязательному доведению до
потребителя информации о наличии в продуктах питания компонентов,
полученных с применением ГМО, в случае, если их содержание составляет
более 0,9%.
2. Утвердить методические указания:
2.1. МУ 2.3.2.2306-07 "Медико-биологическая оценка безопасности
генно-инженерно-модифицированных организмов растительного
происхождения" (приложение 1);
2.2. МУК 4.2.2304-07 "Методы идентификации и количественного
определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного
происхождения" (приложение 2);
2.3. МУК 4.2.2305-07 "Определение генетически модифицированных
микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически
модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной
цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической
детекцией" (приложение 3).
3. Управлениям Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации
и по железнодорожному транспорту:
3.1. Считать осуществление надзора за пищевыми продуктами,
полученными из ГМО, приоритетным направлением деятельности на 2008
год;
3.2. Усилить государственный надзор за производством и оборотом
пищевых продуктов, содержащих ГМО;
3.3. Обеспечить выполнение необходимых лабораторных исследований
по исследованию пищевых продуктов, содержащих ГМО;
3.4. Осуществлять в средствах массовой информации и среди
населения разъяснительную работу по вопросам безопасности пищевых
продуктов, полученных из ГМО, и прав потребителей на получение полной
и достоверной информации;
3.5. Доложить о проделанной работе до 01.04.2008.
4. Управлениям Роспотребнадзора по г. Москве, г.
Санкт-Петербургу, Ростовской области, Нижегородской области,
Свердловской области, Новосибирской области, Хабаровскому краю
активизировать работу головных центров по количественному исследованию
пищевых продуктов на наличие ГМО в федеральных округах.
5. ФГУЗ Центры гигиены и эпидемиологии принять меры по
дооснащению лабораторных подразделений аналитическим оборудованием по
исследованию количественного состава ГМО.
6. ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии"
Роспотребнадзора до 01.03.2008 представить в Роспотребнадзор
информацию о наличии в ФГУЗ "Центры гигиены и эпидемиологии" в
субъектах Российской Федерации аналитического оборудования по
качественному и количественному методам определения ГМО в пищевых
продуктах и подготовке врачей-лаборантов.
7. Просить научно-исследовательские учреждения РАМН, РАН, РАСХН
совместно с научно-исследовательскими учреждениями Роспотребнадзора
уделять приоритетное внимание совершенствованию методов оценки
безопасности и контроля за пищевой продукцией, содержащей ГМО.
8. Контроль за исполнением настоящего Постановления возложить на
заместителя Главного государственного санитарного врача Российской
Федерации Л.П. Гульченко.
Г.Г.ОНИЩЕНКО
30 ноября 2007 г.
N 80
Зарегистрировано в Министерстве юстиции РФ
6 февраля 2008 г.
N 11117
Приложение 1
УТВЕРЖДЕНО
Постановлением
Главного государственного
санитарного врача
Российской Федерации
от 30 ноября 2007 года
N 80
23.2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
БЕЗОПАСНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ОРГАНИЗМОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Методические указания
МУ 2.3.2.2306-07
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению
оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов
растительного происхождения (ГМО).
1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях,
применяются на этапе государственной регистрации ГМО, впервые
поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации.
1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения
единой, научно обоснованной системы оценки безопасности ГМО и
учитывают новые методические подходы, как разработанные в России, так
и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО и др.).
II. ЭКСПЕРТНЫЙ АНАЛИЗ И ОЦЕНКА ДАННЫХ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ
ЗАЯВЛЕННЫЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2.1. Общая характеристика ГМО включает анализ информации,
представленной заявителем:
- информации, позволяющей идентифицировать ГМО (вид, сорт,
трансформационное событие);
- информации об исходном родительском организме (таксономическая
характеристика, описание способа размножения и распространения; данные
о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах);
- информации об организмах-донорах вносимых генов
(таксономическая характеристика, история использования);
- информации о методе генетической модификации (описание метода
модификации, структуры вектора, структуры вставки);
- информации о ГМО (описание свойств, приобретенных растением в
результате модификации, описание структуры генетической конструкции
(внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику
экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза
растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения
и др.), характеристику различий с родительским организмом (способ
размножения, способность к перекрестному опылению, устойчивость к
стрессовым воздействиям и др.), характеристику генетической и
фенотипической стабильности (должны быть представлены данные,
полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО),
характеристику способности к переносу генов в другие организмы
(растения, микроорганизмы).
2.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на
основании сведений, представленных заявителем, о результатах сравнения
химического состава ГМО с химическим составом его традиционного
аналога по следующим параметрам:
- содержание белка;
- аминокислотный состав;
- содержание жира;
- жирнокислотный состав;
- углеводный состав;
- содержание витаминов;
- содержание макро- и микроэлементов;
- содержание биологически активных веществ;
- содержание аллергенов;
- содержание антропогенных и природных контаминантов (токсичных
элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей и
др.);
- содержание антинутриентов и других веществ, характерных для
растительных организмов данного вида.
Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств
изучаемого растительного организма.
2.3. Оценка композиционной эквивалентности ГМО и его
традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний
значений показателей, характерных для растений данного вида.
2.4. Анализ результатов токсикологических исследований проводится
на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- результаты оценки безопасности одного или нескольких белков,
определяющих проявление заданных признаков у ГМО (молекулярная и
биохимическая характеристика белка; наличие или отсутствие гомологии с
токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими
фармакологической или иной биологической активностью (при
использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank и др.);
изучение стабильности белка при обработке, хранении, технологической
переработке; влияние температуры и pH, возможные модификации и/или
образование стабильных белковых фрагментов в результате различных
воздействий; устойчивость белка к обработке протеолитическими
ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной
токсичности белка в эксперименте на грызунах и др.);
- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные
90-дневных исследований на грызунах, данные исследований на молодых
быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.), - в
случае если такие исследования проводились;
- результаты других токсикологических исследований.
2.5. Анализ результатов аллергологических исследований проводится
на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- результаты оценки аллергенных свойств одного или нескольких
белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (сравнение с
известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих
информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и
родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белка
в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE,
выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией;
определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов
(пепсина); скрининговые исследования с использованием сывороток крови
пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в т.ч.
in vivo);
- результаты аллергологических исследований нативного продукта
(сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его
традиционного аналога и др.) должны быть проведены в случае, если
имеются данные об аллергенных свойствах организма-донора.
2.6. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие
исследования были выполнены) проводится на основании сведений,
представленных заявителем, включающих:
- результаты определения пищевой ценности (так как заданные и
незаданные эффекты генетической модификации могут являться причиной
изменения баланса макро- и микронутриентов и, следовательно, вести к
изменению пищевой ценности продукта);
- результаты применения новейших аналитических методов, таких как
профильные технологии и др.
2.7. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга в
стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления
незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть
обнаружены на стадии регистрационных исследований, проводится на
основании сведений, представленных заявителем.
III. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
3.1. Экспертная оценка методов идентификации ГМО направлена на
подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе,
используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за
обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО.
3.2. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и
количественного определения ГМО в пищевых продуктах проводится на
основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- метод идентификации одного или нескольких трансформационных
событий;
- метод количественного определения одного или нескольких
трансформационных событий;
- протоколы проведения анализов;
- описание праймеров;
- стандартные образцы состава и свойств.
IV. МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
4.1. Медико-генетическая оценка ГМО включает проверку присутствия
одной или нескольких синтетических генетических конструкций методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР).
4.2. Медико-генетические исследования проводятся на основании
сведений, представленных заявителем, включающих:
- описание молекулярной структуры одной или нескольких
синтетических генетических конструкций (нуклеотидная
последовательность);
- метод идентификации и количественного определения одного или
нескольких трансформационных событий;
- протокол проведения анализа;
- описание праймеров;
- стандартные образцы состава и свойств.
V. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
5.1. Перечень и объем исследований по разделу V определяются
экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных
испытательных центров Российской Федерации на основании анализа
представленных материалов.
5.2. Изучаемые функциональные свойства:
- pH водной суспензии;
- растворимость;
- реологические свойства водных дисперсий;
- водоудерживающая и жироудерживающая способность;
- критическая концентрация гелеобразования;
- эмульсионная стабильность и др.
VI. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
6.1. Перечень и объем исследований по разделу VI определяются
экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных
испытательных центров Российской Федерации на основании анализа
представленных материалов.
6.2. Гигиенические исследования ГМО включают определение
показателей качества и безопасности:
6.2.1. Перечень показателей безопасности определяется на
основании требований СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования
безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" для соответствующей
группы продуктов.
Изучаемые показатели:
- содержание токсичных элементов;
- содержание микотоксинов;
- содержание пестицидов;
- содержание радионуклидов;
- содержание вредных примесей;
- микробиологические показатели;
- другие показатели (в случае необходимости).
6.2.2. Перечень показателей качества определяется на основании
свойств соответствующего растительного организма, а также анализа
представленных заявителем материалов. В случае если заявителем
представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной
эквивалентности ГМО (содержание белка, аминокислотный состав,
содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание
витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов,
биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ,
характерных для растений данного вида), исследования могут быть
ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира,
углеводов, пищевых волокон.
6.2.3. В случае если генетическая модификация направлена на
изменение химического состава ГМО, должны быть проведены исследования,
подтверждающие заявленные изменения.
6.3. Токсикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте
на лабораторных животных:
6.3.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | крысы линии Вистар |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Пол | самцы |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Возраст | 40 - 50 дней |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 70 - 80 г |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Количество животных в группе | не менее 50 особей в каждой группе |
|в начале эксперимента | |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Распределение по группам |Животных делят на 2 группы: |
| | группа "контроль" получает рацион с |
| | включением традиционного аналога |
| | исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением|
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Рацион |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму |
| |и воде; содержатся в отапливаемом, |
| |вентилируемом помещении |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Продолжительность | 180 дней |
|эксперимента | |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Забор материала для | На 30-й и 180-й дни эксперимента |
|гематологических, | |
|биохимических, | |
|морфологических исследований | |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|Количество животных, взятых | Не менее 10/группу |
|на исследование | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.2. На протяжении эксперимента животные получают
полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его
традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном
количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена
ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков,
жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа
изокалорийности.
Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлен в
табл. 1 - 2.
Таблица 1
Состав базового полусинтетического казеинового рациона
---------------------------------------------------------------------------
| Ингредиенты | Кол-во |Белок| Жиры |Углеводы| Калорийность |
| |--------|-----|-------|--------|--------------|
| | г | г | г | г | ккал | % |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Казеин | 25,0 |20,20| 0,38 | - | 84,22 |22,1 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Крахмал маисовый | 58,0 |0,58 | - | 50,2 | 203,12 |53,3 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Масло подсолнечное | | | | | | |
|нерафинированное | 5,0 | - | 4,99 | - | 44,91 |11,8 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Лярд | 5,0 | - | 4,98 | - | 44,82 |11,8 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Солевая смесь <*> | 4,0 | - | - | - | - | - |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Смесь в/р витаминов <**> | 1,0 | - | - | 1,0 | 4,00 | 1,0 |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Смесь ж/р витаминов <***> | 0,1 | - | 0,1 | - | - | - |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|Микрокристаллическая | | | | | | |
|целлюлоза | 2,0 | - | - | - | - | - |
|--------------------------|--------|-----|-------|--------|--------|-----|
|ИТОГО | 100,1 |20,78| 10,45 | 51,2 | 381,07 | 100 |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав солевой смеси представлен в табл. 2.
<**> 1 г содержит: тиамина (B1) - 0,4 мг, рибофлавина (B2) - 0,6
мг, пиридоксина (B6) - 0,4 мг, никотиновой кислоты - 3,0 мг,
пантотената кальция - 1,5 мг, фолиевой кислоты - 0,2 мг,
цианкобаламина (B12) - 0,003 мг, викасола - 0,1 мг, L-метионина - 50
мг, глюкозы - до 1 г.
<***> 0,1 мл содержит: ретинола ацетата 800 ME, эргокальциферола
- 70 ME, альфа-токоферола ацетата - 5 мг, подсолнечного масла - до 0,1
мл.
Таблица 2
Состав солевой смеси
---------------------------------------------------------------------------
| N | Название соли | Химическая формула |Количество, г|
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 1 | Хлористый натрий | NaCl | 139,3 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 2 | Калий фосфорнокислый | KH2PO4 | 388,8 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 3 | Магний сернокислый | MgSO4 | 57,4 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 4 | Кальций углекислый | CaCO3 | 380,4 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 5 | Железо сернокислое | FeSO4 x 7H2O | 26,4 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 6 | Калий йодистый | KI | 0,77 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 7 | Марганец сернокислый | MnSO4 x 7H2O | 4,55 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 8 | Цинк сернокислый | ZnSO4 x 7H2O | 0,53 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| 9 | Медь сернокислая | CuSO4 x 5H2O | 0,48 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
|10 | Кобальт хлористый | CoCl2 x 6H2O | 0,024 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
|11 | Натрий фтористый | NaF | 0,50 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
|12 | Алюмокалиевые квасцы | K2SO4Al2(SO4)3 x 24H2O | 0,11 |
|---|--------------------------|----------------------------|-------------|
| | ИТОГО | | 1000 |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3. Исследуемые показатели:
6.3.3.1. Интегральные показатели
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели |Периодичность сбора данных |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Общее состояние животных (внешний вид, | каждые 2 дня |
|двигательная активность, состояние шерстного | |
|покрова) | |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Поедаемость корма | ежедневно |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Масса тела | каждые 7 дней |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|Масса внутренних органов (головной мозг, | На 30-й и 180-й дни |
|сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, | эксперимента |
|печень, почки, надпочечники, семенники) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.2. Гематологические показатели
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели |Периодичность сбора данных |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|- концентрация гемоглобина; | На 30-й и 180-й дни |
|- гематокрит; | эксперимента |
|- общее количество эритроцитов; | |
|- средний объем эритроцита (СОЭ); | |
|- среднее содержание гемоглобина в эритроците| |
|(ССЭ); | |
|- средняя концентрация гемоглобина в | |
|эритроците (СКЭ); | |
|- общее количество тромбоцитов; | |
|- общее количество лейкоцитов; | |
|- дифференцированный подсчет лейкоцитов | |
|(нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты,| |
|базофилы) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3. Биохимические показатели
6.3.3.3.1. Общий биохимический анализ крови
Материал для исследований: сыворотка крови
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели |Периодичность сбора данных |
|---------------------------------------------|---------------------------|
|- аланинаминотрансфераза (АЛТ); | На 30-й и 180-й дни |
|- аспартатаминотрансфераза (ACT); | эксперимента |
|- желчные кислоты; | |
|- фосфатаза щелочная; | |
|- билирубин общий; | |
|- билирубин прямой; | |
|- белок общий; | |
|- альбумин; | |
|- глобулин; | |
|- креатинин; | |
|- глюкоза; | |
|- альфа-амилаза; | |
|- липаза; | |
|- лактатдегидрогеназа; | |
|- общие липиды; | |
|- триглицериды; | |
|- холестерин; | |
|- холинэстераза; | |
|- мочевина; | |
|- хлориды; | |
|- натрий; | |
|- фосфор; | |
|- калий | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.2. Общий анализ мочи. Материал для исследований: моча
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|- суточный диурез; | На 30-й и 180-й дни |
|- цвет и прозрачность; | эксперимента |
|- относительная плотность; | |
|- pH; | |
|- белок; | |
|- глюкоза; | |
|- креатинин | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.3. Системные биомаркеры
6.3.3.3.3.1. Система антиоксидантной защиты
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Активность ферментов антиоксидантной защиты.| На 30-й и 180-й дни |
|Материал для исследований: эритроциты | эксперимента |
| - глутатионредуктаза; | |
| - глутатионпероксидаза; | |
| - супероксиддисмутаза; | |
| - каталаза; | |
|--------------------------------------------| |
|Содержание продуктов перекисного окисления | |
|липидов. Материал для исследований: кровь, | |
|печень | |
| - малоновый диальдегид | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.3.2. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков
Материал для исследований: печень
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Активность ферментов 1-й и 2-й фазы | На 30-й и 180-й дни |
|метаболизма ксенобиотиков | эксперимента |
| - общее содержание цитохрома Р-450; | |
| - 7-этоксирезоруфин-О-деэтилаза; | |
| - 7-пентоксирезоруфнн-О-деэтилаза; | |
| - UDP-глюкуронозилтрансфераза; | |
| - глутатионтрансфераза | |
---------------------------------------------------------------------------
6.3.3.3.3.3. Система регуляции апоптоза
1) стабильность мембран лизосом
Материал для исследований: печень
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Общая и неседиментируемая активность | На 30-й и 180-й дни |
|ферментов лизосом | эксперимента |
| - бета-галактозидаза; | |
| - бета-глюкуронидаза; | |
| - арилсульфатазы A и B | |
---------------------------------------------------------------------------
2) другие методы
6.3.3.4. Морфологические исследования
---------------------------------------------------------------------------
| Исследуемые органы | Методы исследований |
|-----------------------------|-------------------------------------------|
|- кожа; |На 30-й и 180-й дни эксперимента (плановый |
|- головной мозг; | забор) |
|- сердце; | |
|- аорта; |1. Макроскопические исследования |
|- селезенка; |2. Микроскопические исследования: |
|- легкие; | а) обзорные гистологические исследования |
| |3. Морфометрический анализ |
| |-------------------------------------------|
|- лимфатические узлы; | Вскрытие погибших в течение эксперимента |
|- тимус; | животных (внеплановый забор) |
|- щитовидная железа; | |
|- гипофиз; |1. Макроскопические исследования |
|- ЖКТ: желудок, тонкая и |2. Микроскопические исследования (перечень |
| толстая кишки; |исследуемых органов может быть сокращен до |
|- печень; |минимально необходимого для установления |
|- поджелудочная железа; |причины смерти): |
|- почки; | а) обзорные гистологические исследования |
|- семенники |-------------------------------------------|
| | Дополнительные исследования |
| | |
| |1. Микроскопические исследования: |
| | а) гистохимические исследования; |
| | б) иммуногистохимические исследования |
| |клеточных популяций и их производных. |
| |2. Электронно-микроскопические |
| |исследования |
---------------------------------------------------------------------------
6.4. Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте
на мышах линий СВА и С57В1/6 и включают изучение его
иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:
1) действие на гуморальное звено иммунитета - в тесте определения
уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;
2) действие на клеточное звено иммунитета - в реакции
гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;
3) действие как сенсибилизирующего агента - в тесте
чувствительности к гистамину;
4) действие на естественную резистентность мышей к Salmonella
typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).
В табл. 3 представлены сравнительные характеристики мышей линий
СВА и С57В1/6.
Таблица 3
Характеристики мышей линий СВА и С57В1/6
---------------------------------------------------------------------------
| Действующий фактор | Линия мышей |
| |------------------------------------------------|
| | СВА | С57В1/6 |
|------------------------|------------------------|-----------------------|
|Эритроциты барана | высокочувствительны | низкочувствительны |
|------------------------|------------------------|-----------------------|
|Гиотамин | не чувствительны | чувствительны |
|------------------------|------------------------|-----------------------|
|Salmonella typhimurium | не чувствительны | чувствительны |
---------------------------------------------------------------------------
6.4.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | мыши линий СВА и С57В1/6 |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | самцы |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | половозрелые |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 18 - 20 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных каждой линии делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион <*> |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на
экспериментальные рационы. В течение эксперимента ведутся наблюдения
за поедаемостью корма и общим состоянием животных.
6.4.2. Исследуемые показатели:
1) действие ГМО на гуморальное звено иммунитета.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 20
животных) и опытной (не менее 20 животных) групп обеих линий
внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн. клеток/мл).
Забор крови для исследований проводится на 7-й, 14-й и 21-й день после
введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют в реакции
гемагглютинации общепринятым методом. Полученные данные обрабатывают
методами вариационной статистики с использованием t-критерия
Стьюдента. Результаты приводятся в виде M +/- m, где M - выборочное
среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка.
2) действие ГМО на клеточное звено иммунитета.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15
животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно
в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (2 млн.
клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы
вводят разрешающую дозу эритроцитов барана - 0,02 мл (1 млрд.
клеток/мышь); в контрлатеральную лапу - 0,02 мл 0,95%-ного раствора
хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20
часов путем определения массы опытной и контрольной лапок.
Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР).
3) действие ГМО как сенсибилизирующего агента к гистамину.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15
животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий
внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл
физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по
проценту гибели мышей.
4) действие ГМО на естественную резистентность мышей к S.
typhimurium изучают на модели внутрибрюшинного заражения мышей
десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм 415. Через 21
день эксперимента мышей контрольной (не менее 30 животных) и опытной
(не менее 30 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами
культуры: 1000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за
животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют ЛД50, а также процент
гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ
результатов.
6.5. Аллергологические исследования ГМО проводятся в эксперименте
на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают,
определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня
циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у
крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и
его традиционный аналог (группа "контроль"). Метод основан на
количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной
анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации
взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с
последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным
разрешающей дозы того же белка.
6.5.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | Крысы линии Вистар |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | Самцы |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | Половозрелые |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 150 - 180 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Количество животных в | не менее 25 особей в каждой группе |
|группе в начале | |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион (табл. 4) |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных. Рацион не содержит яичного |
| |белка |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Продолжительность | 29 дней |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Забор материала для | На 29-й день эксперимента |
|исследований | |
---------------------------------------------------------------------------
Таблица 4
Стандартный рацион вивария
---------------------------------------------------------------------------
| Ингредиент | Масса, г на 1 крысу в день |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Крупа овсяная | 2,5 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Зерновая смесь | 14,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Хлеб 2 сорт | 4,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Творог | 2,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Рыбная мука | 0,5 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Мясо 2 категория | 4,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Морковь | 8,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Зелень | 8,0 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Рыбий жир | 0,1 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Дрожжи | 0,1 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|NaCl | 0,15 |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Основные нутриенты |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Белок | 3,69 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Жир | 1,28 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Углеводы | 12,42 |
|------------------------------|------------------------------------------|
|Энергия, ккал | 76,0 |
---------------------------------------------------------------------------
6.5.2. Исследуемые показатели:
На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на
21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу
антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление
рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят
раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть
развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных
реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического
индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс
отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня
специфических антител.
Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических
антител к ОВА проводят согласно. Статистическую обработку результатов
проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей,
непараметрическим критериям хи-квадрат и Мана-Уитни с использованием
пакетов программ Excel и SPSS 11.5.
6.6. Генотоксикологические исследования ГМО проводятся в
эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной
генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление
мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления
мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в
метафазных клетках пролиферирующих тканей. Регистрация повреждений ДНК
предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного
гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет).
6.6.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | мыши линии С57В1/6 |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | самцы |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | половозрелые |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 18 - 20 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Количество животных в | не менее 15 особей в каждой группе |
|группе в начале | |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион <*> |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Продолжительность | 30 дней |
|эксперимента | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Забор материала для | На 30-й день эксперимента |
|исследований | |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
6.6.2. Исследуемые показатели:
1) в основе метода выявления мутагенной активности лежит
регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного
мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого
животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных
и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по
центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с
полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического
анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными
аберрациями в контрольной и опытной группах.
2) регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности
структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных
клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной
подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток,
заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При
этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след,
напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени
поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение
гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную
денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и
микроскопический анализ.
Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе
с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении
200х - 400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100
"ДНК-комет". Анализ "ДНК-комет" может проводиться визуально или с
помощью программно-аппаратного комплекса.
6.7. Исследования репродуктивной токсичности ГМО проводятся в
эксперименте на лабораторных животных и включают:
1) изучение влияния на генеративную функцию;
2) изучение эмбриотоксического и тератогенного действий,
регистрируемых в пренатальном и постнатальном периодах развития.
6.7.1. Схема проведения эксперимента
---------------------------------------------------------------------------
|Вид животных | крысы линии Вистар |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Пол | самцы, самки |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Возраст | 40 - 50 дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Исходная масса тела | 70 - 80 г |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Количество животных в | не менее 50 особей в каждой группе |
|группе в начале | /\ |
|эксперимента | / |
| | 30 о, 20 о |
| | + |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Распределение по |Животных делят на 2 группы: |
|группам | группа "контроль" получает рацион с включением |
| | традиционного аналога исследуемого ГМО; |
| | группа "опыт" получает рацион с включением |
| | исследуемого ГМО |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Рацион <*> |Пищевая и биологическая ценность рациона |
| |полностью удовлетворяет физиологические |
| |потребности животных |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Карантин |не менее 7-ми дней |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Начало опытного |за 45 - 50 дней перед первым спариванием |
|вскармливания | |
|-----------------------|-------------------------------------------------|
|Условия содержания |Животные получают свободный доступ к корму и |
| |воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом |
| |помещении |
---------------------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.
6.7.2. Исследуемые показатели:
6.7.2.1. Интегральные показатели
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Периодичность сбора данных |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Общее состояние животных (внешний вид, | каждые 2 дня |
|двигательная активность, состояние шерстного| |
|покрова) | |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Поедаемость корма | ежедневно |
|--------------------------------------------|----------------------------|
|Масса тела | каждые 7 дней |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.2.2. Показатели, характеризующие генеративную функцию
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Сроки сбора данных |
|-------------------------------------------------|-----------------------|
|Морфологические исследования семенников | половозрелые особи |
|(определяют индекс сперматогенеза, среднее | |
|количество нормальных сперматогоний в каждом | |
|канальце, относительное количество канальцев с | |
|12-й стадией мейоза) | |
|-------------------------------------------------| |
|Морфологические исследования яичников | |
|(примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и | |
|более слоями фолликулярных клеток, третичные | |
|фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее | |
|количество генеративных форм) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.2.3. Показатели, характеризующие пренатальное развитие
потомства
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Сроки сбора данных |
|-------------------------------------------------|-----------------------|
|1. Забой и вскрытие не менее 7 беременных самок | 19 - 20-й день |
| на группу | беременности |
|-------------------------------------------------| |
|2. Визуальное исследование матки, плаценты, | |
| плодов: выявление живых и мертвых плодов, | |
| подсчет количества желтых тел, мест | |
| имплантации, количество резорбций по правому и| |
| левому рогу матки (с последующим вычислением | |
| пред- и постимплантационной эмбриональной | |
| смертности) | |
|-------------------------------------------------| |
|3. Анализ эмбрионального материала (не менее 5-ти| |
| плодов от каждой крысы) | |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.2.4. Показатели, характеризующие постнатальное развитие
потомства
---------------------------------------------------------------------------
| Изучаемые показатели | Сроки сбора данных |
|------------------------------------------------|------------------------|
|1. Контроль рождения потомства | 20 - 22-й дни |
| | беременности |
|------------------------------------------------|------------------------|
|2. Учет величины помета в день родов, подсчет | 1-й день жизни |
|количества живых и мертвых крысят, подсчет | |
|особей разного пола, установление внешних | |
|уродств, измерение массы тела, определение | |
|краниокаудального размера | |
|------------------------------------------------|------------------------|
|3. Учет показателей физиологического развития | 1 - 30 дни жизни |
|крысят: срок отлипания ушных раковин, появление | |
|первичного волосяного покрова, прорезывание | |
|резцов, открытие глаз, опускание семенников, | |
|открытие влагалища; выживаемость потомства | |
|------------------------------------------------|------------------------|
|4. Измерение массы тела и роста крысят | 1, 4, 7, 14, 21 и 25 |
| | дни жизни |
---------------------------------------------------------------------------
6.7.3. Отчет по результатам исследований репродуктивной
токсичности ГМО должен включать цифровые данные в форме таблиц,
содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или
отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на
внутриутробное развитие и процессы репродукции.
Приложение 2
УТВЕРЖДЕНО
Постановлением Главного
государственного
санитарного врача
Российской Федерации
от 30 ноября 2007 года
N 80
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
МЕТОДЫ
ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Методические указания
МУК 4.2.2304-07
I. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы
идентификации и количественного определения генно-инженерно -
модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения в
пищевых продуктах.
1.2. Представлены скрининговые методы, направленные на выявление
и количественное определение рекомбинантной ДНК: промотора 35S из
вируса мозаики цветной капусты, терминатора NOS из Agrobactetium
tumefaciens и маркерных генов, позволяющие проводить предварительную
проверку пищевой продукции.
1.3. Представлены методы, направленные на идентификацию и
количественное определение рекомбинантной ДНК, характерной для
генетических конструкций и уникальных трансформационных событий, для
осуществления окончательной идентификации линии ГМО растительного
происхождения.
II. АППАРАТУРА, ИНСТРУМЕНТЫ, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА,
РЕАКТИВЫ
2.1. Для проведения идентификации и количественного определения
ГМО растительного происхождения используется следующая аппаратура и
инструменты:
- амплификаторы типа ABI Prism 7000, iCycler iQ, Rotor Gene -3000
(6000), AHK-32, "Терцик МС-2" и другие;
- комплекс аппаратно-программный для анализа биологических
микрочипов типа "ДЕРМИГЕН-001";
- прибор для горизонтального электрофореза типа "Mini-Sub Cell GT
System" с комплектом кювет и гребенок;
- источник напряжения типа "Power Pac 300" с диапазоном
регулируемого напряжения 50 - 300 В;
- трансиллюминатор типа Т12 с защитным экраном, диапазон
излучения 300 - 400 нм;
ТМ
- видеосистема типа "Gel Doc 2000 ", предназначенная для ввода в
компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих
следов
ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием, чувствительность - не
менее 10
нг ДНК (по бромистому этидию);
- холодильник бытовой электрический типа "Электролюкс", с
температурой морозильной камеры минус 20 град.C;
- микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не
-1
менее 13000 мин. );
- термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф
вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 град.C до 120
град.C, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность
поддержания температуры - 0,2 град.C, разность температур между
соседними ячейками - не более 0,5 град.C;
- термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 42
град.C, рабочий диапазон от 20 град.C до 60 град.C, точность
поддержания температуры +/- 1 град.C;
- аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250
-1
- 3000 мин. ;
- печь микроволновая (мощностью не менее 400 W);
- весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с
наибольшим пределом взвешивания 200 г;
- анализатор потенциометрический типа МР 220, погрешность
измерений pH +/- 0,01;
- гомогенизатор перистальтического типа "Стомайкер" или других
моделей;
- облучатель бактерицидный настенный типа ОБН-150;
- дозаторы с переменным объемом дозирования: 0,2 - 2,0 мкл с
шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 1,2%; 0,5 - 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл,
с точностью +/- 0,8%; 2 - 20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/-
0,8%; 20 - 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +/- 0,6%; 100 - 1000
мкл с шагом 1 мкл, с точностью +/- 3%; 2 - 10 мл с шагом 0,1 мл, с
точностью +/- 0,5%.
2.2. Для проведения идентификации и количественного определения
ГМО растительного происхождения используется следующая лабораторная
посуда:
- цилиндры мерные лабораторные вместимостью 10, 25, 100, 1000 мл,
корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 327263-2 EA, Z 327301-2
ЕА, Z 327379-2 ЕА, Z 327476-2 ЕА;
- колбы мерные лабораторные вместимостью 25, 50, 100, 250, 1000
мл, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 329517-1 EA, Z
329525-1 EA, Z 329533-1 ЕА, Z 329541-1 EA, Z 329576-1 EA;
- пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2,
0,5, 1,5 мл;
- наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом
дозирования до: 10; 20; 200; 1000 мкл; 10 мл.
2.3. Для проведения идентификации и количественного определения
ГМО растительного происхождения используются следующие реактивы:
- кислота соляная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Н
1758;
- кислота борная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В
7901;
- натрий едкий, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N 221465;
- натрий хлористый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N S
3014;
- этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), корпорация "Сигма
Алдрич" (Sigma), кат. N Е 5134;
- гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАВ), корпорация "Сигма
Алдрич" (Sigma), кат. N Н 5882;
- трис (оксиметил) аминометан, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Т 6791;
- альбумин бычий сывороточный сухой (БСА), корпорация "Сигма
Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287;
- этидий бромистый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Е
4391;
- спирт этиловый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат N
459836;
- спирт изопропиловый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N
19516;
- хлороформ, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N 151823;
- вода деионизированная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат.
N W 4502;
- вода дистиллированная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат.
N W 3500;
- 2-меркаптоэтанол, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N М
3148;
- термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в
области 70 град.C - 72 град.C, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат.
N Д 1806;
- буфер для ПЦР с MgCl2, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат.
N Р 2192;
- агароза для электрофореза (тип П), корпорация "Сигма Алдрич"
(Sigma), кат. N А 6877;
- маркер молекулярной массы ДНК, корпорация "Сигма Алдрич"
(Sigma), кат. N Р 1473;
- стандартный образец состава генетически немодифицированного
организма растительного происхождения, корпорация "Сигма Алдрич"
(Fluka), кат. N 53198;
- стандартный образец состава ГМО растительного происхождения,
корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka), кат. N 44386;
- 2`-дезоксиаденозин-5`трифосфорной кислоты тетранатриевая соль,
тригидрат (АТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4788;
- 2`-дезоксицитидин-5`трифосфорной кислоты тетранатриевая соль,
тригидрат (ЦТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4913;
- 2`-дезоксигуанозин-5`трифосфорной кислоты тетранатриевая соль,
тригидрат (ГТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 5038;
- 2`-дезокситимидин-5`трифосфорной кислоты тетранатриевая соль,
тригидрат (ТТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 9656;
- праймеры, ЗАО "Синтол" (Россия);
- натрия додецилсульфат (SDS), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N L 4390;
- 3%-ный раствор перекиси водорода, корпорация "Сигма Алдрич"
(Sigma), кат. N 7722.
2.4. Допускается использование другой аппаратуры, инструментов и
реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше
отечественного и зарубежного производства, разрешенные для применения
в установленном порядке.
III. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
3.1. Приготовление растворов:
- для приготовления 1М ТРИС - HCl (pH 7,5) в мерной колбе на 100
мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана в 80 мл
дистиллированной воды, довести pH концентрированной соляной кислотой
до 7,5, довести объем раствора до метки деионизованной водой,
перемешать, хранить при температуре -20 град.C в течение не более года;
- для приготовления 5М NaCl растворить 29,22 г натрия хлористого
в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с
притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года;
- для приготовления 30%-ной NaOH растворить 3 г натрия гидроокиси
в 7 мл дистиллированной воды;
- для приготовления 0,5М ЭДТА (pH 8,0) в мерной колбе на 100 мл
растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты в 80 мл
дистиллированной воды, раствором 30%-ной натрия гидроокиси довести pH
раствора до 8,0, дистиллированной водой объем раствора довести до
метки, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной
температуре до 1 года.
3.2. Приготовление хлороформа, насыщенного водой:
- смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и
оставить на 24 ч для насыщения;
- срок хранения при температуре от 4 град. C до 5 град.C - не
более 6 мес.
3.3. Приготовление 70%-го раствора этилового спирта:
- смешать 70 мл 96%-го этилового спирта с 26 мл деионизированной
воды;
- срок хранения при температуре от 4 град.C до 5 град.C - не
более 2 мес.
3.4. Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл):
- растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1
мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990
мкл деионизированной воды;
- срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20
град.C - не более 6 мес.
3.5. Приготовление лизирующего буфера (2%-го "СТАВ"):
- растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл
деионизированной воды, добавить 2,5 мл 1M Трис - HCl, 7 мл 5М NaCl, 1
мл 0,5М ЭДТА, довести объем раствора деионизированной водой до 25 мл,
перемешать;
- срок хранения при температуре от 4 град.C до 5 град.C - не
более 6 мес.
3.6. Приготовление 1 x ТВЕ буфера для электрофореза:
- в мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 г Трис (оксиметил)
аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной
кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до
полного растворения;
- срок хранения 1х раствора - 10 дней.
3.7. Приготовление раствора бромистого этидия - C21H20N3Br (10
мг/мл):
- растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной
воды;
- срок хранения в посуде темного стекла при температуре от 4
град.C до 5 град.C - 12 мес.
3.8. Приготовление осаждающего буфера СТАВ:
- в мерную колбу внести 1 г СТАВ, 0,5 г NaCl, добавить 100 мл
деионизированной воды, довести раствором 30%-ной натрия гидроокиси pH
раствора до 8,0, довести объем деионизированной водой до 200 мл;
- хранить при 4 град.C не более 6 месяцев.
3.9. Приготовление 1,2М NaCl:
- растворить 7,0 г NaCl в 100 мл деионизированной воды,
перемешать;
- хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре
до 1 года.
3.10. Приготовление 10%-го раствора SDS:
- растворить 10 г SDS в 90 мл дистиллированной воды;
- хранить при комнатной температуре не более 1 года.
IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК
4.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ:
- навеску исследуемого гомогенизированного продукта массой 100 мг
поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл;
- добавить 300 мкл деионизированной воды, перемешать шпателем;
- добавить 500 мкл лизирующего СТАВ-буфера с меркаптоэтанолом,
тщательно перемешать шпателем;
- инкубировать при 65 град.C 90 минут;
- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
- перенести 500 мкл супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл;
- добавить 500 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;
- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
- перенести 500 мкл верхней фракции в чистую пробирку, добавить
500 мкл хлороформа, перемешать;
- центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;
- перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа;
- добавить 2 объема СТАВ-осаждающего буфера, перемешать
пипетированием;
|