|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |2 мин./98 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град. C, 30 сек./60 град. C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза, продукт амплификации - 102 пары нуклеотидов, приложение
2.21.
VI. ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ
6.1. Приготовление 2%-ного агарозного геля:
- к 1 г агарозы добавить 50 мл 1х буфера ТВЕ, тщательно
перемешать;
- полученный раствор поместить в микроволновую печь на 2 - 5 мин
или прокипятить на водяной бане 15 мин до полного расплавления
агарозы;
- расплавленную агарозу охладить до 56 град.C, добавить 5 мкл
бромистого этидия, тщательно перемешать, разлить в подготовленную
форму, толщина геля 0,5 - 0,7 см, через 30 - 40 минут удалить
гребенку;
- готовый гель использовать сразу или хранить в 1х ТВЕ буфере в
холодильнике при +4 град.C.
6.2. Проведение электрофореза:
- 10 мкл реакционной смеси после аплификации внести в лунку геля,
в одну из лунок внести маркер молекулярной массы:
- поместить заполненный гель в камеру для электрофореза с буфером
1х ТБЕ, толщина слоя буфера над поверхностью геля ~ 2 - 3 мм;
- провести электрофорез в режиме постоянного напряжения 100V 70 -
90 минут;
- гель (без формы) поместить на экран трансиллюминатора;
- документировать результат фореза при помощи
гель-документирующей системы, фотокопию геля приложить к отчету по
идентификации.
VII. ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
7.1. Используются следующие праймеры:
- на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:
5` CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA (39 н.о.),
5` CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40
н.о.);
- на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
5` ACC GTA CCT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA (33 н.о.),
5` TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA (30 н.о.);
- на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
5` GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG ACA GA (32 н.о.),
5` GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);
- на маркерный ген nptII из транспазона Tn5 бактериального
происхождения:
5` GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG C (25 н.о.),
5` ACC CAG CCG GCC ACA GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.):
- на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
5` AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA (32 н.о.),
5` CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).
7.2. Набор реактивов для асимметричной мультиплексной ПЦР (амПЦР)
включает:
- сухие смеси, включающие Taq ДНК полимеразу,
дезоксинуклеозидтрифосфаты, хлорид магния с конечными концентрациями,
соответственно, 1 ед. 200 мкМ и 2,5 млМ, оптимизированную буферную
систему для проведения одной стандартной ПЦР:
- растворитель;
- минеральное масло;
- "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 мл.
7.3. Проведение реакции:
- необходимое количество микропробирок с сухими реактивами
промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые
пробы", "+" контроль";
- добавить во все пробирки по 5 мкл праймеров, 10 мкл
растворителя;
- в пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5
мкл деионизированной воды, в опытные пробирки - по 5 мкл раствора
исследуемой ДНК, в пробирку с положительным контролем - 5 мкл раствора
контрольной ДНК;
- добавить во все пробирки по 20 мкл минерального масла;
- пробы готовы для проведения амплификации;
- запустить программу амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
|Шаг программы| Температура, |Время инкубации, сек| Количество циклов |
| | град.С | | |
|-------------|------------------|--------------------|-------------------|
| 1) | 94 | 180 | 1 |
|-------------|------------------|--------------------|-------------------|
| 2) | 94 | 30 | 42 |
|-------------|------------------|--------------------| |
| 3) | 62,5 | 30 | |
|-------------|------------------|--------------------|-------------------|
| 4) | 72 | 180 | 1 |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для осуществления
гибридизации.
7.4. Гибридизация ДНК, ферментный анализ на биологическом
микрочипе и сканирование результатов:
- набор реактивов для ДНК гибридизации и ферментного анализа
содержит 20 x SSC - 50 мл, диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток,
конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 мл с концентрацией
1 мг/мл, 1 пробирка;
- приготовить рабочие разведения раствора 20 x SSC (3 М NaCl, 0,3
М цитрат натрия, pH 7,4): 2 x SSC, 0,1% SDS; 0,1 x SSC; 0,1 x SSC,
0,1% SDS; 0,01 x SSC;
- схема приготовления 100 мл раствора:
---------------------------------------------------------------------------
| Раствор | 20 x SSC, мл | 10%-ный SDS, мл | H2O дист., мл |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 2 x SSC, 0,1% SDS | 10,00 | 1 | 89,00 |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 0,1 x SSC | 0,50 | - | 99,50 |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 0,1 x SSC, 0,1% SDS | 0,50 | 1 | 98,50 |
|----------------------|---------------|-----------------|----------------|
| 0,01 x SSC | 0,05 | - | 99,95 |
---------------------------------------------------------------------------
- микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1
- 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки, добавить в каждую
микропробирку 5 мкл 20 x SSC и 0,2 мкл 10% SDS, перемешать,
центрифугировать 1 - 2 секунды при 3000 об/мин, распределить
полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны
иммобилизованных олигонуклеотидов;
- поместить микрочип во влажную камеру, поставить на 1 час в
воздушный термостат с температурой 42 °C;
- по окончании реакции капли смыть буфером 2 x SSC, 0,1% SDS,
тщательно промыть чип растворами 2 x SSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 минут,
0,1 x SSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут, 0,1 x SSC - 5 раз по 1
минуте, 0,01 x SSC - в течение 10 секунд.
7.5. Проведение ферментного анализа:
- исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200
раз буфером 1 x SSC, содержащим 1% БСА (бычий сывороточный альбумин),
из расчета 25 мкл на микрочип;
- нанести 25 - 30 мкл разведенного конъюгата на рабочую зону
микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной
температуре;
- смыть конъюгат раствором 1 x SSC;
- залить микрочип раствором 2 x SSC, промыть 5 минут;
- промыть микрочип раствором 1 x SSC;
- непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата
- диаминобензидина (ДАБ), для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см3
буфера 0,1 x SSC, добавить 30 мм3 3%-ного раствора пероксида водорода
и перемешать, раствор использовать немедленно;
- залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата, выдержать от
2 до 10 минут при комнатной температуре;
- в случае положительной реакции появляются коричневые пятна
окисленного субстрата;
- промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды
и поместить в термостат 42 °C на 5 - 10 минут, после сушки микрочип с
окрашенными зонами хранить в темном месте.
7.6. Сканирование биологических микрочипов:
- осуществлять с применением аппаратно-программного комплекса для
анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" и компьютерной
программы для анализа изображений;
- в соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в
комплекте с аппаратно-программным комплексом, подготовить сканер
микрочипов к работе;
- поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его
и закрыть рамку;
- запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом
режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и
только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно
детектора;
- после завершения сканирования микрочипа сохранить изображение,
присвоив файлу соответствующее имя.
7.7. Анализ изображений биочипов:
- запустить программу обработки изображения микрочипа, ввести
оцифрованное изображение в программу, для этого выбрать опцию "Файл",
открыть изображение, в появившемся диалоговом окне выбрать формат, в
котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл,
изображение появится в основном окне программы;
- провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры
измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого
выбрать опцию "Анализ", "Разметка матрицы";
- разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны
которого проходят через центры узлов крайних столбцов, для этого нужно
щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки,
затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину
появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла;
- в результате предварительной разметки на экране появится
четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в
соответствии с заданным числом столбцов матрицы, чтобы завершить
разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять";
- после завершения базовой разметки провести автоматическую
коррекцию положения зондов, для этого в меню выбрать опцию
"Настройки/Автоматическая подстройка";
- для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" -
"Показать результаты", по окончании измерений программа предоставляет
возможность подготовки и распечатки протокола испытаний, для этого
нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем "Заполнить протокол", после
этого появится окно с формой для заполнения, после того как она будет
заполнена, нажать кнопку "Выход".
7.8. Интерпретация результатов:
- появление регистрируемого компьютерной программой оптического
сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации,
содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие
рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного
происхождения в анализируемом образце;
- отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти
гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды,
указывает на отсутствие рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том,
что анализируемый образец не имеет ГМО растительного происхождения;
- появление оптического сигнала в зоне гибридизации при
использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о
получении ложноположительного результата, причиной может быть
загрязнение реактивов и/или оборудования, в этом случае необходимо
обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1H
соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить
анализ;
- отсутствие оптического сигнала при использовании положительного
контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного
результата, причиной могут быть потеря активности одного из
компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с
применением ферментного анализа на биологическом микрочипе, в этом
случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить
анализ.
VIII. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
8.1. Метод количественного определения генетически
модифицированной сои:
- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК,
характерную для генетически модифицированных линий сои в пищевых
продуктах методом ПЦР в реальном времени;
- анализ проводится по гену лектина, который присутствует в
геноме всех линий сои, и универсальной последовательности 35 S
промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в
геноме всех генетически модифицированных линий сои;
- праймеры на ген лектина:
1) 5` TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3`;
2) 5` GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3`;
3) 5`-FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3`;
длина ампликона 81 пара нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCC TCT GCC GAC AGT GGT 3`;
5) 5` AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C 3`;
6) 5`-FAM-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-TAMRA-3`;
длина ампликона 82 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК сои:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |900 нмоль/л каждого |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 ммоль/л каждого |
|(2,5 ммоль/л каждого) | |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Праймер 3 |100 нмоль/л |
|-----------------------------------|-------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 |900 нмоль/л каждого |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP|200 ммоль/л каждого |
|(2,5 ммоль/л каждого) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймер 6 |100 нмоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- при проведении исследования использовали стандартные образцы
состава генетически модифицированной сои;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Доамплификационный |2 мин./50 град. C |
|период | |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Денатурация |10 мин./95 град. C |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Амплификация |15 сек./95 град. C, |
| |60 сек./60 град. C измерение |
|---------------------|---------------------------------------------------|
|Количество циклов |45 |
|амплификации | |
---------------------------------------------------------------------------
- результаты исследования, приложение 2.22.
8.2. Метод количественного определения генетически
модифицированной кукурузы:
- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК,
характерную для генетически модифицированных линий кукурузы, в пищевых
продуктах методом ПЦР в реальном времени;
- анализ проводится по гену инвертазы кукурузы, который
присутствует в геноме всех линий кукурузы, и универсальной
последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты,
который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий,
за исключением GA 21;
- праймеры на ген инвертазы кукурузы:
1) 5` CAC TCC ATC GTG GAG AGC TT 3`;
2) 5` GGC GTT GTT GAA GAG GAA GA 3`;
3) 5`-FAM-TAC CCC ACA CGA GCC ATC TAC GAC T-TAMRA-3`;
длина ампликона 111 пар нуклеотидов;
- праймеры, на целевую последовательность ГМО:
4) 5` CGT CTT CAA AGC AAG TGG ATT G 3`;
5) 5` TCT TGC GAA GGA TAG TGG GAT T 3`;
6) 5`-FAM-TCT CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG CA-TAMRA-3`;
длина ампликона 79 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
--------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл | | Реактивы | Объем, мкл |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 | |Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | | |количество ДНК 200 нг) | |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 | |Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 | |Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси | | |Концентрация в реакционной смеси |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л | |MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |900 нмоль/л каждого | |Праймеры 1, 2 |900 нмоль/л каждого |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л | |dUTP |400 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, |200 ммоль/л каждого | |Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, |200 ммоль/л каждого |
|dGTP (2,5 ммоль/л каждого) | | |dGTP (2,5 ммоль/л каждого) | |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймер 3 |100 нмоль/л | |Праймер 3 |100 нмоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------| |----------------------------------|--------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл | |Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
--------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |10,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Буфер для ПЦР без MgCl2 (10 X) | 5,00 |
|----------------------------------|--------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|MgCl2 (25 ммоль/л) | 5 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 |900 нмоль/л каждого |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|dUTP |400 ммоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, |200 ммоль/л каждого |
|dGTP (2,5 ммоль/л каждого) | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Праймер 6 |100 нмоль/л |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Деионизированная вода |Довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- при проведении исследования использовали стандартные образцы
состава генетически модифицированной кукурузы;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 °C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |10 мин./95 °C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация |15 сек./95 °C, 30 сек./60 °C измерение|
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |50 |
---------------------------------------------------------------------------
- результат исследований, приложение 2.23.
8.3. Метрологические характеристики метода:
- границы интервала, в котором погрешность определения находится
с доверительной вероятностью Р = 0,95, составляют от 0,1% до 5%,
нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием
сертифицированных стандартных образцов состава и свойств, стандартные
отклонения повторяемости результатов (дельта) составляют от 0,067 (для
стандарта 0,1%) до 0,540 (для стандарта 5%), что соответствует
погрешности сертифицированных стандартных образцов состава ГМО
растительного происхождения:
- результаты анализа образцов принимают, если коэффициент
корреляции калибровочной прямой, построенной по сертифицированным
стандартным образцам состава ГМО растительного происхождения, по
2
методу наименьших квадратов (R ) > 0,97.
8.4. Метод количественного определения сои линии 40-3-2:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена лектина и
генетической конструкции, характерной для сои линии 40-3-2;
- используются зонды, специфичные к трансгену и гену лектина,
меченные красителями FAM и VIC соответственно;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной сои: 5,0%, 2,0%, 1,0%,
0,5% и 0,00%;
- праймеры на ген лектина сои:
1) 5` TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3`;
2) 5` GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3`;
3) 5`-VIC-AAC GGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3`;
- на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3`;
5) 5` GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3`;
6) 5`-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-TAMRA-3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |18,30 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,10 каждого |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 0,25 каждого |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймеры 3, 6 (10 мкМ) | 0,50 каждого |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР (10 X) |10,60 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.C |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град.C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.5. Метод количественного определения сои линии A2704-12:
- основан на ПЦР в реальном времени, с определением гена лектина
и области ДНК, специфичной трансформационному событию А2704-12;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной сои А2704-12: 0,1%, 0,4%,
0,9%, 2,0%; 3,3%;
- праймеры на ген лектина сои:
1) 5` CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA 3`;
2) 5` TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC 3`;
3) 5` FAM-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-TAMRA-3`;
длина ампликона 105 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT 3`;
5) 5` ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT 3`;
6) 5`-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-TAMRA-3`;
длина ампликона 64 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК сои:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |18,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,5 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 1,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |17,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 1,0 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 1,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.6. Метод количественного определения кукурузы линии MON 810:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез группы белков, присущих для всех линий кукурузы
(hmg) и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 810,
на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции
промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты:
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: < 0,02%, 0,1%,
0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%:
- праймеры на ген hmg:
1) 5` TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCC CA 3`;
2) 5` GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T 3`;
3) 5`-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA-3`;
длина ампликона 79 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT 3`;
5) 5` GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT 3`;
6) 5`-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-TAMRA-3`;
длина ампликона 92 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,3 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,1 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 0,5 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0 |
|количество ДНК 50 - 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 0,25 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 0,5 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,6 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,4 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,0 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.7. Метод количественного определения кукурузы линии MON 863:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
MON 863, на границе генома кукурузы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,01%, 1,0%,
5,0%, 10,0%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3`;
2) 5` CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3`;
3) 5`-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3`;
длина ампликона 84 пары нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3`;
5) 5` TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3`;
6) 5`-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-TAMRA-3`;
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.8. Метод количественного определения кукурузы линии NK 603:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
NK 603, на границе генома кукурузы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%,
0,98%, 1,96%, 4,91%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3`;
2) 5` CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3`;
3) 5`-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3;
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3`;
5) 5` AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T 3`;
6) 5`-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TC-TAMRA-3`;
длина ампликона 108 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 4,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |19,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) | 0,75 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (5 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) |10,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |10,60 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,40 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |50,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.9. Метод количественного определения кукурузы линии Bt 11:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
Bt 11, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,3%,
0,7%, 1,0%, 1,3%, 2,0%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3`;
2) 5` CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3`;
3) 5`-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3`;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA 3`;
5) 5` TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG 3`;
6) 5`-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-TAMRA-3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 6,000 |
|количество ДНК 250 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 9,000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (20 мкМ) | 0,375 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 0,500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,500 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 4,000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,000 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 6,0000 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 7,7500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (20 мкМ) | 0,9375 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 0,6250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,5000 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,2500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,0000 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.10. Метод количественного определения кукурузы линии T 25:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию T
25, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,15%, 0,40%,
0,90%, 2,00%, 3,30%:
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT 3`;
2) 5` CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3`;
3) 5`-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3`;
длина ампликона 136 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC 3`;
5) 5` GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG 3`;
6) 5`-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-TAMRA-3`;
длина ампликона 102 пары нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 9,75 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) | 0,50 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,50 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 8,75 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) | 1,00 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,50 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,50 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (50 млМ) | 4,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,00 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.11. Метод количественного определения кукурузы линии GA 21:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
GA 21, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%,
0,98%, 1,3%, 1,71%, 4,26%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3`;
2) 5` CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3`;
3) 5`-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-TAMRA-3`;
длина ампликона 70 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA 3`;
5) 5` TGG CTC GCG ATC CTC CT 3`;
6) 5`-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA GGT GGG
T-TAMRA-3`;
длина ампликона 112 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 300 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор | 5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |150,00 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400,00 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200,00 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 | 50,00 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,00 |
|количество ДНК 300 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор | 5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 |150,00 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400,00 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200,00 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 | 50,00 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 50,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.12. Метод количественного определения кукурузы линии MIR 604:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех
линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
MIR 604, на границе генома кукурузы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM и VIC;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава и свойств генетически модифицированной кукурузы: менее
0,09%, 0,1%, 0,98%, 9,85%;
- праймеры на ген adhl 1:
1) 5` CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3`;
2) 5` CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3`;
3) 5`-VIC-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3`;
длина ампликона 136 пар нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` GCG CAC GCA ATT CAA CAG 3`;
5) 5` GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT 3`;
6) 5`-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-TAMRA-3`;
длина ампликона 76 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК кукурузы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 250 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 |300 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5,00 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 4 |600 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 5 |300 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
---------------------------------------------------------------------------
8.13. Метод количественного определения риса линии LL 62:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез фосфолипазы Д (PLD), присущей для всех линий риса и
области ДНК, специфичной трансформационному событию LL 62, на границе
генома риса и элемента генетической конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAМ;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированного риса: менее 0,09%,
0,45%, 0,9%, 1,8%, 3,6%;
- праймеры на ген PLD;
1) 5` TGG TGA GCG TTT TGC AGT CT 3`;
2) 5` CTG ATC CAC TAG CAG GAG GTC C 3`;
3) 5`-FAM-TGT TGT GCT GCC AAT GTG GCC TG-TAMRA-3`;
длина ампликона 64 пары нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3`;
5) 5` TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3`;
6) 5`-FAM-CGC ACC GAT TAT TTA TAC TTT TAG TCC ACC-TAMRA-3`;
длина ампликона 88 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК риса:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (10 мкМ) |200 нмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (10 мкМ) |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное |5,00 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|