- инкубировать 60 минут при комнатной температуре;
- центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;
- удалить супернатант;
- растворить осадок в 350 мкл NaCl (1,2М);
- добавить 350 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;
- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
- перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл;
- добавить 0,6 объема изопропилового спирта, перемешать;
- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
- удалить супернатант;
- добавить 500 мкл 70%-го раствора этилового спирта и перемешать
на вортекс;
- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
- удалить супернатант;
- подсушить осадок не более 5 минут при 65 град.C для удаления
капель спирта;
- растворить осадок в 100 мкл деионизированной воды, осторожно
встряхивая, полученный раствор ДНК готов для проведения полимеразной
цепной реакции (ПЦР);
- хранить при минус 20 град.C.
4.2. Сорбционный метод выделения ДНК:
- в центрифужные пробирки типа Эппендорф на 1,5 мл внести 300 мг
бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала, добавить 0,5 мл 5 мМ
Na2-соль ЭДТА и термостатировать 30 - 60 минут при 65 град.C;
- к содержимому пробирки добавить 400 мкл лизирующего реагента,
перемешать на вортекс до максимально однородного состояния,
термостатировать при 65 град.C 60 - 120 минут;
- перемешать на вортекс, добавить 500 мкл бидистиллированной
воды, перемешать на вортекс;
- центрифугировать 1 минуту при 12000 об./мин., прозрачный
супернатант перенести в чистую пробирку;
- добавить 20 мкл сорбента, пробирку поместить на ротатор или
перемешивать на вортекс 10 минут при 10 - 20 об./мин.;
- центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;
- удалить супернатант, к осадку добавить 200 мкл лизирующего
реагента, перемешать на вортекс до однородного состояния,
центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;
- удалить супернатант, к осадку добавить 1 мл рабочего раствора
солевого буфера, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 -
10 раз, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;
- удалить супернатант, не задевая осадка;
- к осадку добавить 1 мл рабочего раствора солевого буфера,
перемешать на вортекс, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.,
удалить супернатант;
- повторить предыдущий пункт еще раз;
- подсушить осадок при 65 град.C в течение 4 - 5 минут:
- к осадку добавить 50 мкл экстракционного раствора, отбор
раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не
допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы;
- суспендировать содержимое пробирки на вортекс 5 - 10 секунд до
гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65 град.C;
- повторно суспендировать пробу на вортекс, центрифугировать 1
минуту при 12000 об./мин.;
- раствор ДНК перенести в чистую пробирку, хранить при минус 20
град.C.
V. ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
5.1. Идентификация видоспецифичной растительной ДНК.
5.1.1. Идентификация ДНК сои, ген лектина:
- праймеры:
1) 5` GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 3`;
2) 5` GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |193,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град. C, 30 сек./60 град. C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 118 пар
нуклеотидов, приложение 2.1.
5.1.2. Идентификация ДНК кукурузы, ген зеина:
- праймеры:
1) 5` TGC TTG CAT TGT TCG CTC TCC TAG 3`;
2) 5` GTC GCA GTG ACA TTG TGG CAT 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |193,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 мМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |1 мин./94 град.C, 1 мин./60 град.C, |
| |1 мин./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |7 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 329 пар
нуклеотидов, приложение 2.2.
5.1.3. Идентификация ДНК картофеля, ген фосфоенолпируват
карбоксилазы:
- праймеры:
1) 5` GTC TCC TTG GCT TGT CAT TTT ATG C 3`;
2) 5` CAA GTT AGC TGC CAT CAT TCT GGC C 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |188,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |1 мин./94 град.C, 1 мин./60 град.C, |
| |1 мин./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |7 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 1149 пар
нуклеотидов, приложение 2.3.
5.2. Скриниговый анализ.
5.2.1. Метод идентификации промотора 35 S:
- праймеры:
1) 5` GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3`;
2) 5` GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин./4 град.С |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Скорость нагрева |0,77 град. C/сек. |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Скорость остывания |3,15 град. C/сек. |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 195 пар
нуклеотидов, приложение 2.4.
5.2.2. Метод идентификации терминатора NOS:
- праймеры:
1) 5` GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3`;
2) 5` TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин./4 град.С |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 180 пар
нуклеотидов, приложение 2.5.
5.2.3. Метод идентификации маркерного гена npt II:
- праймеры:
1) 5` GGA TCT CCT GCT ATC T 3`;
2) 5` GAT CAT CCT GAT CGA C 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |16,53 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 3,30 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 3,30 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 0,62 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (32 пикомоль/мкл) | 0,40 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (59 пикомоль/мкл) | 0,20 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,15 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амилификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град.C, 50 сек./50 °град.C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 173 пары
нуклеотидов, приложение 2.6.
5.3. Идентификация линий ГМО.
5.3.1. Метод идентификации сои линии 40-3-2:
- 1-й раунд, внешние праймеры:
1) 5`CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG 3`;
2) 5`CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |188,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град. C, 30 сек./60 град. C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |25 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы поместить на холод,
хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда;
- 2-й раунд, внутренние праймеры:
3) 5` ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA 3`;
4) 5` TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |193,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 3 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 4 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град. C, 30 сек./60 град. C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |35 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза, продукт амплификации 169 пар нуклеотидов, приложение
2.7.
5.3.2. Метод идентификации сои линии A2704-12:
- праймеры:
1) 5` GGC GTT CGT AGT GAC TGA GG 3`;
2) 5` GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 185 пар
нуклеотидов, приложение 2.8.
5.3.3. Метод идентификации сои линии А5547-127.
- праймеры:
1) 5` TGT GGT TAT GGC GGT GCC ATC 3`;
2) 5` TGC TAC AGG CAT CGT GGT GTC 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 150 пар
нуклеотидов, приложение 2.9.
5.3.4. Метод идентификации кукурузы линии Bt 176:
- 1-й раунд, внешние праймеры:
1) 5` CGG CCC CGA GTT CAC CTT 3`;
2) 5` CTG CTG GGG ATG ATG TTG TTG 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |188,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |40 сек./95 °C, 40 сек./60 °C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |25 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы поместить на холод,
хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда;
- 2-й раунд, внутренние праймеры:
3) 5` CCG CAC CCT GAG CAG CAC 3`;
4) 5` GGT GGC ACG TTG TTG TTC TGA 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |193,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 3 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 4 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |40 сек./95 град.C, 40 сек./60 град.C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |35 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 189 пар
нуклеотидов, приложение 2.10.
5.3.5. Метод идентификации линии MON 810:
- 1-й раунд, внешние праймеры:
1) 5` TAT CTC CAC TGA CGT AAG GGA TGA C 3`;
2) 5` TGC CCT ATA ACA CCA ACA TGT GCT T 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |188,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |45 сек./95 град.C, 50 сек./60 град.C, |
| |50 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |35 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- 2-й раунд, внутренние праймеры:
3) 5` ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCTC 3`;
4) 5` GCA TTC AGA GAA ACG TGG CAG TAA C 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |193,70 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 25,00 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,50 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 3 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 4 (20 мкМ) | 6,25 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,30 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать (30 секунд при 3000 об./мин.), при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./95 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |45 сек./95 град.C, 50 сек./60 град.C, |
| |50 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 149 пар
нуклеотидов, приложение 2.11.
5.3.6. Метод идентификации кукурузы линии MON 863:
- праймеры:
1) 5` GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3`;
2) 5` TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемещать на вортекс и центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин. - 4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации 84 пары
нуклеотидов, приложение 2.12.
5.3.7. Метод идентификации кукурузы линии NK 603:
- праймеры:
1) 5` AGT AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3`;
2) 5` AAG AGA TAA CGA GAT CCA CTC AAA CAC T 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин. - 4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 108 пар
нуклеотидов, приложение 2.13.
5.3.8. Метод идентификации кукурузы линии Bt 11:
- праймеры:
1) 5` CCA TTT TTC AGC TAG GAA GTT C 3`;
2) 5` TCG TTG ATG TTK GGG TTG TTG TCC 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |10 мин./95 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град.C, 60 сек./63 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |10 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град. C, 30 сек./60 град. C, |
| |30 сек./95 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |30 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |7 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин. - 4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 110 пар
нуклеотидов, приложение 2.14.
5.3.9. Метод идентификации кукурузы T 25:
- праймеры:
1) 5` GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA 3`;
2) 5` TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |10 мин./95 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град.C, 60 сек./63 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |10 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град. C, 30 сек./60 град. C, |
| |30 сек./95 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |30 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |7 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин. - 4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 149 пар
нуклеотидов, приложение 2.15.
5.3.10. Метод идентификации кукурузы линии GA 21:
- праймеры:
1) 5` ACG GTG GAA GAG TTC AAT GTA TG 3`;
2) 5` TCT CCT TGA TGG GCT GCA 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин. - 4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 270 пар
нуклеотидов, приложение 2.16.
5.3.11. Метод идентификации кукурузы линии MIR 604:
- праймеры:
1) 5` GGT ACC CAT TTG GCG CCG AT 3`;
2) 5` CAG CGT TGC GGT TCT GTC AG 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор ДНК | 0,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 1,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 1,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буферная смесь | 2,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза | 0,2 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |19,8 |
---------------------------------------------------------------------------
- состав буферной смеси:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|1 M KCL |500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dATP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dCTP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dTTP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dGTP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ MgC2 |150 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |170 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|1 М Tris-HCl-pH 8,3 |100 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |4 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 °C, 30 сек./55 °C, |
| |2 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |34 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |5 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |до конца/4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 895 пар
нуклеотидов, приложение 2.17.
5.3.12. Метод идентификации кукурузы линии MON 88017:
- праймеры:
1) 5` GAG CAG GAC CTG CAG AAG CT 3`;
2) 5` TCC GGA GTT GAC CAT CCA 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор ДНК | 0,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 1,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 1,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буферная смесь | 2,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза | 0,2 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |19,8 |
---------------------------------------------------------------------------
- состав буферной смеси:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|1 M KCL |500 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dATP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dCTP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dTTP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ dGTP | 20 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|100 мМ MgC2 |150 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |170 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|1 М Tris-HCl-pH 8,3 |100 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |4 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 °C, 30 сек./55 °C, |
| |2 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |34 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |5 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |до конца/4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 94 пары
нуклеотидов, приложение 2.18.
5.3.13. Метод идентификации сахарной свеклы линии Н7-1:
- праймеры:
1) 5` TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3`;
2) 5` AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин./4 град.С |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 110 пар
нуклеотидов, приложение 2.19.
5.3.14. Метод идентификации риса LL 62:
- праймеры:
1) 5` AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3`;
2) 5` TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |169,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 7,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |3 мин./94 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |20 сек./94 град.C, 40 сек./54 град.C, |
| |60 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |40 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |1 мин./4 град.С |
---------------------------------------------------------------------------
- после проведения амплификации пробы готовы для проведения
электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 88 пар
нуклеотидов, приложение 2.20.
5.3.15. Метод идентификации картофеля, устойчивого к колорадскому
жуку сортов Рассет Бурбанк Ньюлив, Супериор Ньюлив, Елизавета 2904/1
kgs, Луговской 1210 amk:
- 1-й раунд, внешние праймеры:
1) 5` CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC 3`;
2) 5` ATG CAC TCA CGT AGT CCT CC 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |161,3 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 33,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 1 (20 мкМ) | 2,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 2 (20 мкМ) | 2,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Денатурация |2 мин./98 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Амплификация |30 сек./95 град. C, 30 сек./60 град. C, |
| |40 сек./72 град.C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |20 |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Конечное удлинение |3 мин./72 град. C |
|--------------------------------|----------------------------------------|
|Фаза остывания |4 град.C |
---------------------------------------------------------------------------
- хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го
раунда;
- 2-й раунд, внутренние праймеры:
3) 5` CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC 3`;
4) 5` TTG TAT AGA AGC TCA CGA GG 3`;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Деионизированная вода |164,8 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) | 33,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33,0 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 3 (20 мкМ) | 2,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Праймер 4 (20 мкМ) | 2,5 |
|--------------------------------------|----------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 1,5 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30
секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по
24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку,
перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при
использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку
добавить каплю минерального масла;
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|