|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) |0,25 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X |5,00 |
|------------------------------------|------------------------------------|
| |Концентрация в реакционной смеси |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор |5 ммоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (10 мкМ) |400 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP |400 мкмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP |200 мкмоль/л каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (10 мкМ) |200 нмоль/л |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода |довести до 25,00 мкл |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Доамплификационный период |2 мин./50 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
8.14. Метод количественного определения сахарной свеклы линии
H7-1:
- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена,
кодирующего синтез глютамин синтетазы (GS), присущей для всех линий
сахарной свеклы и области ДНК, специфичной трансформационному событию
H7-1, на границе генома сахарной свеклы и элемента генетической
конструкции;
- используются зонды, меченные красителем FAM;
- для построения калибровочной прямой используются стандартные
образцы состава генетически модифицированной сахарной свеклы: менее
0,1%, 0,5%, 0,9%, 2,0%, 5,0%;
- праймеры на ген GS:
1) 5` GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG 3`;
2) 5` GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA 3`;
3) 5`-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3`;
длина ампликона 121 пара нуклеотидов;
- праймеры на целевую последовательность ГМО:
4) 5` TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3`;
5) 5` AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3`;
6) 5`-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT-TAMRA-3`;
длина ампликона 110 пар нуклеотидов;
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение ДНК сахарной свеклы:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0000 |
|количество ДНК 200 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 9,2000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 1, 2 (100 мкМ) | 0,0375 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 3 (100 мкМ) | 0,0250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,5000 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 5,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,2000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Краситель ROX (25 мкМ) | 1,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,0000 |
---------------------------------------------------------------------------
- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное
определение рекомбинантной ДНК:
---------------------------------------------------------------------------
| Реактивы | Объем, мкл |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Раствор целевой ДНК (максимальное | 5,0000 |
|количество ДНК 125 нг) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Деионизированная вода | 7,0750 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймеры 4, 5 (100 мкМ) | 0,1000 каждого |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Праймер 6 (100 мкМ) | 0,0250 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|dUTP (20 млМ) | 0,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Смесь нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP | 0,5000 каждого |
|(10 млМ) | |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Буфер для ПЦР 10 X | 2,5000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|MgCl2 раствор (25 млМ) | 7,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Taq-полимераза (5 единиц/мкл) | 0,2000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Краситель ROX (25 мкМ) | 1,0000 |
|------------------------------------|------------------------------------|
|Итого: |25,0000 |
---------------------------------------------------------------------------
- условия амплификации:
---------------------------------------------------------------------------
| Стадия | Программа амплификации |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация первичная |10 мин./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Амплификация | |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Денатурация |15 сек./95 град.С |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Отжиг |60 сек./60 град. C измерение |
|----------------------------------|--------------------------------------|
|Количество циклов амплификации |45 |
---------------------------------------------------------------------------
IX. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГМО
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-СИСТЕМ
9.1. Метод количественного определения генно-инженерно -
модифицированной сои и кукурузы с использованием наборов "TaqMan GMO
Soy Detection Kit" и "TaqMan GMO Maize Detection Kit":
- наборы реактивов предназначены для количественного определения
в пищевых продуктах генно-инженерно-модифицированной кукурузы или сои;
- метод основан на ПЦР в реальном времени;
- амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех
линий кукурузы или сои, и участок рекомбинантной ДНК в ходе двух
независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и
зондов, меченых флуоресцентным красителем;
- регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами
типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием
программного обеспечения приборов;
- относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается
с использованием стандартных образцов состава путем сравнения
результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для
ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC,
специфичного для всех линий сои или кукурузы;
- выделение ДНК из стандартных образцов состава и из исследуемых
образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или
набора реактивов "ДНК-сорб-С".
9.2. Метод идентификации и количественного определения ГМО с
использованием наборов "Ампликвант ГМ соя", "Ампликвант ГМ кукуруза",
"АмплиСенс ГМ соя FTR", "АмплиСенс ГМ кукуруза FTR", разработанных
ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.
9.2.1. Набор реактивов "Ампликвант ГМ соя":
- предназначен для количественного определения
генно-инженерно-модифицированной сои;
- метод основан на ПЦР в реальном времени;
- амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех
линий сои, и участок рекомбинантной ДНК, промотора 35 S из вируса
мозаики цветной капусты, в ходе двух независимых реакций с
использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых
флуоресцентным красителем;
- регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами
типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием
программного обеспечения приборов;
- относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается
с использованием стандартных образцов состава путем сравнения
результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для
ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC,
специфичного для всех линий сои;
- выделение ДНК из стандартных образцов состава и из исследуемых
образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или
набора реактивов "ДНК-сорб-С".
9.2.2. Набор реактивов "Ампликвант ГМ кукуруза":
- предназначен для количественного определения генно-инженерно -
модифицированной кукурузы;
- метод основан на ПЦР в реальном времени;
- амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех
линий кукурузы, и участок рекомбинантной ДНК, промотора 35 S из вируса
мозаики цветной капусты, в ходе двух независимых реакций с
использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых
флуоресцентным красителем;
- регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами
типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием
программного обеспечения приборов;
- относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается
с использованием стандартных образцов состава путем сравнения
результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для
ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC,
специфичного для всех линий кукурузы;
- выделение ДНК из стандартных образцов состава из исследуемых
образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ (или
набора реактивов "ДНК-сорб-С").
9.2.3. Набор реактивов "АмплиСенс ГМ соя FRT":
- предназначен для идентификации генно-инженерно-модифицированной
сои в пищевых продуктах и растительном сырье методом ПЦР в реальном
времени;
- анализ представляет собой проведение трех ПЦР в одной пробирке,
для каждой из которых используются специфичные праймеры и меченый
флуоресцентными красителями зонд;
- в двух реакциях выявляются последовательности ДНК, специфичные
для просмотра 35 S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS
in Agrobactetium tumefaciens, третья предназначена для амплификации
эндогенной ДНК, специфичной для всех линий сои;
- выделение ДНК осуществляется с помощью СТАВ или набора
реактивов "ДНК-сорб-С".
9.2.4. Набор реактивов "АмплиСенс ГМ кукуруза FRT":
- предназначен для идентификации генно-инженерно-модифицированной
кукурузы в пищевых продуктах и растительном сырье методом ПЦР в
реальном времени;
- анализ представляет собой проведение трех ПЦР в одной пробирке,
для каждой из которых используются специфичные праймеры и меченый
флуоресцентными красителями зонд;
- в двух реакциях выявляются последовательности ДНК, специфичные
для промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS
из Agrobactetium tumefaciens, третья предназначена для амплификации
эндогенной ДНК, специфичной для всех линий кукурузы;
- выделение ДНК осуществляется с помощью СТАВ или набора
реактивов "ДНК-сорб-С".
9.2.5. Выделение ДНК с использованием набора реактивов
"ДНК-сорб-С":
- буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 прогреть
при 64 град.C до полного растворения кристаллов;
- в каждую пробирку внести по 400 мкл буфера для лизирующего
реагента и по 17 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать;
- инкубировать при 64 град.C 1 час, периодически встряхивая на
вортекс;
- центрифугировать 5 минут при 12000 - 14000 об./мин.;
- отобрать и перенести надосадочную жидкость в объеме 200 - 350
мкл в чистые пробирки;
- центрифугировать 5 секунд при 5000 об./мин.;
- тщательно ресуспендировать сорбент на вортекс, в каждую
пробирку добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента, перемешать
на вортекс, оставить в штативе на 10 - 15 минут, перемешивая каждые 2
минуты;
- центрифугировать 1 минуту при 5000 об./мин., удалить
супернатант;
- добавить по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на
вортекс до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировать 1
минуту 5000 об./мин.;
- удалить супернатант;
- добавить по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на
вортекс до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировать 1
минуту при 10000 - 12000 об./мин., отобрать супернатант;
- повторить процедуру отмывки, отобрать супернатант полностью,
поместить пробирки в термостат 64 град.C на 5 - 10 минут для
подсушивания сорбента, при этом крышки пробирок должны быть открыты;
- добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, перемешать на
вортекс;
- поместить в термостат 64 град.C на 5 - 8 минут, периодически
встряхивая на вортекс;
- центрифугировать 1 минуту при 12000 - 14000 об./мин.;
- раствор ДНК хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до
8 град.C и в течение 1 года - при температуре минус 20 град.C.
9.3. Методы количественного определения сои линии 40-3-2,
кукурузы линии GA 21, кукурузы линии NK 603, кукурузы линии MON 863,
разработанные Центром "Биоинженерия" РАН.
9.3.1. Наборы реактивов для количественного определения сои линии
40-3-2, кукурузы линии GA 21, кукурузы линии NK 603, кукурузы линии
MON 863 методом ПЦР в реальном времени:
- в состав каждого набора входят 2 пробирки матричной реакционной
смеси, 1 пробирка с термостабильной полимеразой, 8 пробирок со
стандартными разведениями рекомбинантной ДНК;
- реакционная смесь на одну пробу содержит 9,25 мкл матричной
реакционной смеси, 0,75 мкл термостабильной полимеразы, 32,0 мкл
деионизированной воды, конечный объем каждой пробы - 50 мкл;
- реакционную смесь разлить в пробирки по 42 мкл на пробу;
- добавить 8 мкл раствора ДНК в следующем порядке - контроль без
ДНК, ДНК 0%, ГМО 0,5%, ГМО 100%, исследуемые образцы;
- центрифугировать;
- условия амплификации: 94 град.C - 9 мин. - 1 цикл (94 град.C -
30 сек.) + (62 град.C - 30 сек.) + (72 град.C - 1 мин.) - 40 циклов;
- наборы реактивов оптимизированы для работы на амплификаторах
типа ABI Prism 7000/7700.
9.3.2. Метод выделения ДНК с применением технологии Wizard,
Promega:
- навеску исследуемого продукта массой 100 мг поместить в
микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
- добавить 300 мкл - буфера I (50 мМ Трис HCl, pH - 8,0; 10 мМ
ЭДТА; 50 мкг/мл панкреатической РНКазы свободной от ДНКаз, 3 М
гуанидин тиоцианата) при комнатной температуре;
- растереть пробу в пробирке пестиком до гомогенного состояния;
- добавить 400 мкл буфера II (2% додецилсульфат натрия, 0,2 М
NaOH) и перемешать на вортекс;
- инкубировать при 65 град.C 30 минут, перемешать на вортекс,
охладить до комнатной температуры;
- добавить 400 мкл буфера III (5 М ацетат калия, pH 4,5),
перемешать на вортекс 2 минуты;
- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;
- надосадок отобрать и перенести в чистую пробирку типа Эппендорф
вместимостью 1,5 мл, добавить смолу Wizard MaxiPreps из расчета 100
мкл смолы на 200 мкл надосадочной жидкости и перемешать на вортекс;
- при помощи стерильного шприца емкостью 2 мл прокачать смесь
через микроцентрифужную колонку;
- стерильным шприцом емкостью 2 мл прокачать через
микроцентрифужную колонку 2 мл промывочного буфера (0,2 М NaCl, 20 мМ
Трис HCl, pH - 8,0, 5 мМ ЭДТА смешать в соотношении 5:7 с 96%
этанолом);
- поместить микроколонку в микроцентрифужную пробирку типа
Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
- центрифугировать 1 минуту при 13000 об./мин.;
- поместить микроколонку в чистую микроцентрифужную пробирку типа
Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
- добавить в колонку 100 мкл деионизированной воды, нагретой до
65 град.C, центрифугировать 15 секунд при 13000 об./мин.;
- измерить концентрацию раствора ДНК и довести ее до 10 нг/мкл;
- раствор ДНК хранить при минус 20 град.C.
9.4. Количественное определение сои линии 40-3-2, кукурузы линий
GA 21, MON 810, T-25, Bt-176, Bt-11 с использованием наборов реагентов
GeneScan Analytics GmbH.
9.4.1. Наборы реактивов для определения сои линии 40-3-2
TM
(GMOQuant Roundup Ready Soy), кукурузы линии Bt-176 (GMOQuant
TM
Maximizer Bt 176 corn), кукурузы линии Bt-11 (GMOQuant Bt-11 Corn),
TM
кукурузы линии MON 810 (GMOQuant YieldCard MON 810), кукурузы линии
TM
T-25 (GMOQuant LibertyLink T25 Corn), кукурузы линии GA 21 (GMOQuant
TM
Roundup Ready GA 21 Corn):
- используется реакционная смесь, позволяющая амплифицировать
участок эндогенной ДНК, характерной для кукурузы или сои, и
реакционная смесь, позволяющая амплифицировать участок рекомбинантной
ДНК;
- каждая реакционная смесь содержит соответствующие праймеры и
зонд, меченный флуоресцентным красителем FAM, специфичный для ГМО и
VIC, специфичный для сои или кукурузы;
- интенсивность флуоресценции измеряют с помощью приборов типа
ABI-PRISM 7000, iCycler iQ и анализируют с применением программного
обеспечения приборов.
9.4.2. Метод выделения ДНК с помощью набора реагентов "GENESpin":
- набор "GENESpin" предназначен для выделения геномной ДНК из
пищевых продуктов;
- исследуемый образец пищевого продукта гомогенизировать,
добавить лизируюший буфер, содержащий денатурирующие агенты и
детергенты;
- лизат центрифугировать;
- добавить связывающий буфер и этанол для создания оптимальных
условий осаждения ДНК на фильтре со специально подобранным
силикагелем;
- промыть буфером для удаления потенциальных ингибиторов
ДНК-полимеразы;
- ДНК элюировать водой или буфером, хранить при минус 20 град.C.
9.5. Методы количественного определения сои линии 40-3-2,
кукурузы линии MON 810, разработанные ГУ ВНИИ сельскохозяйственной
биотехнологии РАСХН:
9.5.1. Принцип методов:
- для количественного определения ГМО одновременно проводятся две
независимые реакции в одной пробирке, одна реакция позволяет
обнаруживать ДНК сои или кукурузы, другая - последовательность,
специфичную для сои линии 40-3-2 или кукурузы линии MON 810;
- для обнаружения ДНК сои или кукурузы используется зонд, меченый
красителем R6G, для обнаружения генетической конструкции - красителем
FAM или ROX в зависимости от типа прибора;
- интенсивность флуоресценции измеряют с помощью приборов типа
АНК-32, ABI-PRISM 7000, iCycler iQ и анализируют с применением
программного обеспечения приборов;
- определение процентного содержания ГМО осуществляется с
использованием калибровочных образцов (КО), которые представляют собой
смеси ДНК растения дикого типа (0%) и ДНК ГМО (100%) в определенном
процентном соотношении, разность значений пороговых циклов двух
реакций для калибровочных образцов используется для построения
калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается
процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых пробах.
9.5.2. Метод выделения ДНК "Сорб-ГМО":
- измельченные навески образцов перенести в одноразовые
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл;
- внести в каждую пробирку по 600 мкл лизирующего буфера и 10 мкл
лизирующего реагента, тщательно перемешать;
- инкубировать 50 - 60 минут при 65 град.C, периодически
перемешивая на вортекс;
- внести в каждую пробирку по 500 мкл хлороформа, интенсивно
перемешать, центрифугировать 10 минут при 12 000 - 14 000 об./мин.;
- верхнюю водную фазу в объеме 300 мкл аккуратно, не захватывая
хлороформ и межфазный слой, перенести в пробирку с сорбентом,
интенсивно перемешать на вортекс до полного ресуспензирования
сорбента, инкубировать при комнатной температуре 10 минут,
периодически встряхивая;
- центрифугировать суспензию при 10 000 об./мин. 1 минуту,
удалить супернатант;
- добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора А, перемешать
на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента, инкубировать
при комнатной температуре 2 - 3 минуты, периодически встряхивая;
- центрифугировать при 7 000 об./мин. 30 секунд, удалить
супернатант;
- добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора Б, перемешать
на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента;
- центрифугировать суспензию при 7 000 об./мин. 30 секунд,
удалить супернатант;
- добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора В, перемешать
на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента;
- центрифугировать при 7 000 об./мин. 30 секунд, удалить
супернатант;
- поместить пробирки с открытыми крышками в термостат при
температуре 65 град.C на 5 минут для испарения жидкости;
- к сухому осадку добавить 100 мкл ТЕ буфера, перемешать на
вортекс, инкубировать 10 минут при температуре 65 град.C, перемешивая
каждые 2 минуты;
- центрифугировать при 12 000 - 14 000 об./мин. 2 минуты;
- чистую надосадочную жидкость перенести в чистую пробирку
объемом 0,5 - 1,5 мл, не захватывая сорбент.
9.5.3. Порядок проведения исследований:
- взять необходимое количество пробирок с реакционной смесью из
тест-системы из расчета N + 8, где N - количество анализируемых
образцов;
- после размораживания реакционной смеси центрифугировать
пробирки 30 - 60 секунд при более 4000 об./мин.;
- внести в пробирки по 2 мкл исследуемых образцов и в последнюю
очередь калибровочных образцов сои или кукурузы в двух повторах,
перемешать многократным пипетированием, поместить пробирки в
амплификатор;
- программа амплификации для сои: 10 мин./95 град.C, 20 сек./95
град.C, 50 сек. / 62 град.C, съемка 50 циклов, 25 град.C - хранение;
- программа амплификации для кукурузы: 10 мин./95 град.C, 20 сек.
/ 95 град.C, 50 сек./60 град.C, съемка 50 циклов, 25 град.C -
хранение.
9.6. Для определения ГМО растительного происхождения допустимо
использование тест-систем с техническими характеристиками,
аналогичными указанным выше и разрешенными для использования в
установленном порядке.
Приложение 2.1
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации ДНК сои (ген лектин).
Продукт ПЦР - 118 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои.
3. Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК.
4 - 7. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из продуктов
переработки сои.
Приложение 2.2
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации ДНК кукурузы (ген зеин).
Продукт ПЦР - 329 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
2 - 5. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной кукурузы.
6. Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК.
Приложение 2.3
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации ДНК картофеля (ген фосфоенолпируваткарбоксилазы).
Продукт ПЦР - 1149 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней
нетрансгенного картофеля.
3. Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК.
Приложение 2.4
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК (мишень - промотор 35S).
Продукт ПЦР - 195 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1 - 3. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои
линии 40-3-2.
4. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои.
5. Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК.
6. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.5
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК (мишень - терминатор NOS).
Продукт ПЦР - 180 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1 - 3. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои
линии 40-3-2.
4. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои.
5. Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК.
6. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.6
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК (маркерный ген nptII).
Продукт ПЦР - 173 пары нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Контроль качества реакционной смеси - ПЦР в отсутствие
матричной ДНК.
2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии MON 863.
Приложение 2.7
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для генетической
конструкции сои линии 40-3-2.
Продукт ПЦР - 169 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
2. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои.
3 - 4. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои
линии 40-3-2.
Приложение 2.8
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для генетической
конструкции сои линии А2704-12.
Продукт ПЦР - 185 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои.
3 - 6. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои
линии А2704-12.
Приложение 2.9
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для генетической
конструкции сои линии А5547-127.
Продукт ПЦР - 150 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян сои линии
А5547-127.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян
нетрансгенной сои.
3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.10
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для генетической
конструкции кукурузы линии Bt-176.
Продукт ПЦР - 189 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии Bt-176.
3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
Приложение 2.11
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для генетической
конструкции кукурузы линии MON 810.
Продукт ПЦР - 149 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии MON 810.
3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии MON 810.
Приложение 2.12
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линии MON
863.
Продукт ПЦР - 84 пары нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии MON 863.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.13
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линии NK
603.
Продукт ПЦР - 108 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии NK 603.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.14
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линии Bt
11.
Продукт ПЦР - 110 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии Bt 11.
Приложение 2.15
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линии T 25.
Продукт ПЦР - 149 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии T 25.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.16
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линии GA
21.
Продукт ПЦР - 270 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии GA 21.
Приложение 2.17
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линии MIR
604.
Продукт ПЦР - 894 пары нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии MIR 604.
4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
Приложение 2.18
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линии MON
88017.
Продукт ПЦР - 94 пары нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна
нетрансгенной кукурузы.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы
линии MON 88017.
3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.19
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для сахарной свеклы
линии H7-1.
Продукт ПЦР - 110 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
2 - 3. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из корнеплодов
сахарной свеклы линии H7-1.
4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из корнеплодов
нетрансгенной сахарной свеклы.
Приложение 2.20
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для риса, устойчивого к
глюфосинату аммония, линии LL 62.
Продукт ПЦР - 88 пар нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян риса линии
LL 62.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян
нетрансгенного риса.
3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.21
(обязательное)
Пример представления данных электрофореза по результатам
идентификации рекомбинантной ДНК, характерной для сортов картофеля,
устойчивых к колорадскому жуку:
Рассет Бурбанк Ньюлив, Супериор Ньюлив, Елизавета 2904/kgs,
Луговской 1210 amk.
Продукт ПЦР - 102 пары нуклеотидов.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля
сорта Рассет Бурбанк Ньюлив.
2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля
сорта Супериор Ньюлив.
3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля
сорта Елизавета 2904/kgs.
4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля
сорта Луговской 1210 amk.
5. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней
нетрансгенного картофеля.
6. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).
Приложение 2.22
(обязательное)
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества
циклов ПЦР для гена лектина.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества
циклов ПЦР для рекомбинантной ДНК.
Расчет количества рекомбинантной ДНК.
По кривой амплификации определяется пороговый цикл для каждой ПЦР
(Ct). Рассчитывается разность между Ct специфичным для 35 S промотора
и Ct специфичным для гена лектина. Относительное количество
рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле:
-(дельтаCt sam - дельтаCt ref)
w = 2 x c ref,
где:
дельтаCt sam - разность между значениями Ct для 35 S промотора и
гена лектина в исследуемом образце;
дельтаCt ref - разность между значениями Ct для 35 S промотора и
гена лектина в стандартном образце;
c ref- концентрация стандартного образца.
Приложение 2.23
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества
циклов ПЦР для гена зеина.
Рисунок
----------------------------------------------------------------------
Не приводится.
Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества
циклов ПЦР для рекомбинантной ДНК.
Расчет количества рекомбинантной ДНК.
По кривой амплификации определяется пороговый цикл для каждой ПЦР
(Ct). Рассчитывается разность между Ct специфичным для 35 S промотора
и Ct специфичным для гена зеина. Относительное количество
рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле:
-(дельтаCt sam - дельтаCt ref)
w = 2 x c ref,
где:
дельтаCt sam - разность между значениями Ct для 35 S промотора и
гена лектина в исследуемом образце;
дельтаCt ref - разность между значениями Ct для 35 S промотора и
гена лектина в стандартном образце;
c ref - концентрация стандартного образца.
Приложение 3
УТВЕРЖДЕНО
Постановлением
Главного государственного
санитарного врача
Российской Федерации
от 30 ноября 2007 года
N 80
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ И МИКРООРГАНИЗМОВ, ИМЕЮЩИХ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫЕ АНАЛОГИ, В ПИЩЕВЫХ
ПРОДУКТАХ МЕТОДАМИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ И ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
Методические указания
МУК 4.2.2305-07
I. Область применения
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методы
определения генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов (ГММ) в
пищевой продукции, полученной из/или с использованием генно-инженерно
- модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих
генно-инженерно-модифицированные аналоги (МГМА), посредством
полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени или ПЦР с
детекцией результатов методом электрофореза.
1.2. Методические указания предназначены для применения в
лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека, а также в других
испытательных лабораториях, аккредитованных в установленном порядке на
право проведения исследований пищевых продуктов и продовольственного
сырья.
1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения
единого методического подхода для определения ГММ в пищевых продуктах,
продовольственном сырье, пищевых и биологически активных добавках к
пище.
II. Общие положения
2.1. Методические указания содержат описание молекулярно -
генетических методов идентификации ДНК (дезоксирибонуклеиновых кислот)
генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах,
полученных из/или с использованием генно-инженерно-модифицированных
микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно -
модифицированные аналоги. Методы являются скрининговыми и обеспечивают
выявление наиболее типичных маркерных и селективных генов,
используемых в генетических конструкциях по технологии рекомбинантных
ДНК в различных группах микроорганизмов (бактерии, дрожжи, плесневые
грибы), используемых в пищевой промышленности. Идентификация этих
генов методом ПЦР позволяет проводить качественный анализ пищевой
продукции на наличие ГММ.
2.2. Методические указания предусматривают также количественный
анализ содержания ДНК ГММ посредством использования специальных
стандартов ДНК с известной концентрацией в формате ПЦР в реальном
времени.
2.3. При обнаружении генетических модификаций методом ПЦР
проводят дополнительные исследования с целью идентификации разрешенных
(в том числе путем подтверждения их принадлежности к конкретной
генетической конструкции) или для выявления не разрешенных для
реализации населению и использования в пищевой промышленности в
Российской Федерации ГММ и пищевых продуктов на основе ГММ.
Исследования проводят в соответствии с методическими указаниями,
официально утвержденными в установленном порядке.
2.4. Идентификация ГММ, разрешенных для реализации населению и
использования в пищевой промышленности в Российской Федерации в
образцах продукции и/или используемых культурах штаммов ГММ,
проводится на основании сведений, представляемых изготовителем
(разработчиком) в Роспотребнадзор, с полной информацией о:
- генной вставке (описание источника и нуклеотидной
последовательности целевого гена и его регуляторных элементов;
описание средств доставки целевого гена в клетки реципиента -
физическая карта вектора, наличие полилинкеров и селективных
маркеров);
- о методах идентификации и количественного определения ДНК ГММ.
2.5. Представленные в методических указаниях методы выделения ДНК
из образцов пищевой продукции, проведения амплификации с детекцией
продуктов ПЦР путем электрофореза или в режиме реального времени с
использованием специального оборудования, документирования и анализа
получаемых результатов являются обязательными при проведении как
качественных, так и количественных исследований ГММ и МГМА.
III. Молекулярно-генетический анализ
пищевой продукции, полученной с использованием
генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов
и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно -
модифицированные аналоги, методом ПЦР с детекцией
результатов методом электрофореза
3.1. Необходимость проведения лабораторных исследований для
конкретных видов пищевой продукции, полученной с использованием ГММ и
МГМА, определяется экспертом с учетом анализа представленной
заявителем документации, перечня микроорганизмов, используемых в
пищевой промышленности и имеющих генно-инженерно-модифицированные
аналоги. Экспертные исследования включают подтверждение данных,
предоставленных заявителем, а при необходимости - проверку на наличие
возможных недекларированных генетических модификаций.
3.2. Для обнаружения ГММ проводят исследования на наличие
трансгенов (чужеродных генов), регуляторных или маркерных векторных
последовательностей. Наличие таких последовательностей свидетельствует
о произведенных генетических модификациях. Обнаружение
последовательностей таких генов производят с помощью специфичного и
высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).
3.3. Рекомендуемые стратегии международных организаций (ФАО/ВОЗ)
для выявления генетических модификаций предусматривают определение
наиболее часто употребляемых последовательностей векторов - плазмид, с
помощью которых генетическая информация вводится в клетку. В качестве
маркеров используют гены, по которым проводят селекцию
модифицированных клеток (гены антибиотикорезистентности,
бактериоцинов), последовательности регуляторных векторных генов
(полилинкеры, промоторы или терминаторы), а также последовательности
мигрирующих элементов. Обнаружение таких последовательностей
свидетельствует о возможных недокументированных генетических
модификациях и требует проведения дополнительных исследований штаммов
и/или продуктов.
3.4. Проведение дополнительных исследований осуществляют с
использованием методов гибридизационного и рестрикционного анализа,
секвенирования, анализа функционирования целевой вставки (изучение РНК
и белка, продуцируемых чужеродной ДНК) в соответствии с официально
утвержденными методами анализа.
3.5. Для качественного определения ДНК генно-инженерно -
модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах и биологически
активных добавках к пище (БАД) методом ПЦР используют тест-системы,
включающие многокомпонентные наборы реагентов и праймеров
(искусственно синтезированных олигонуклеотидов, комплементарных
соответствующим участкам ДНК-мишени), предназначенные для выявления
селективных маркерных генов, наиболее часто употребляемых при
конструировании ГММ. Обнаружение маркерных генов у штаммов
микроорганизмов, используемых при производстве пищевых продуктов,
свидетельствует о произведенных генетических модификациях.
В тест-системы входят праймеры, фланкирующие следующие
последовательности:
1) гена ermC, кодирующего устойчивость к эритромицину, плазмиды
pE194 Staphylococcus aureus (размер фрагмента 349 п.н.);
2) гена tetO, кодирующего устойчивость к тетрациклину хромосомы
Streptococcus pneumoniae (размер фрагмента 242 п.н.);
3) гена amp, кодирующего устойчивость к ампициллину, плазмиды
pBR322 Esherichia coli (размер фрагмента 321 п.н.);
4) гена lacZ, кодирующего фермент бета-галактозидазу, хромосомы
Esherichia coli (размер фрагмента 158 п.н.);
5) гена ori, кодирующего ориджин репликации, плазмиды p15A
Esherichia coli (размер фрагмента 382 н.п.);
6) гена hph, кодирующего устойчивость к гигромицину, хромосомы
Streptomyces hygroscopicus (размер фрагмента 288 н.п);
7) гена Sh ble, кодирующего устойчивость к блеомицину, хромосомы
Streptomyces verticillus (размер фрагмента 301 н.п.).
3.6. Выбранный в соответствии с правилами молекулярного дизайна и
международных баз данных (с применением программ "Oligo 4.0", "Blast"
и их аналогов) набор праймеров обеспечивает проведение многофакторного
анализа выбранных последовательностей.
3.7. Для каждой конкретной пары праймеров ПЦР проводят с
использованием оптимального соотношения компонентов реакционной смеси,
структуры программы амплификации (временных и температурных
характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода
детекции результатов, для исключения перекрестных реакций с
неспецифическими ДНК и обеспечения необходимого уровня
чувствительности и специфичности реакции.
3.8. Специфичность и чувствительность наборов праймеров и
реагентов (положительные результаты ПЦР в пробах с контролями ДНК
4
селективных маркеров при концентрации не менее 5 x 10 ГЭ/мл,
отсутствие перекрестных реакций с неспецифическими ДНК при
3
концентрации не менее 1 x 10 ГЭ/мл) подтверждают на препаратах ДНК,
выделенных из штаммов микроорганизмов, указанных в таблице 1.
Таблица 1
---------------------------------------------------------------------------
|N N| Микроорганизм | Номер штамма |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 1 | Escherichia coli | M-17 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 2 | Lactobacillus acidophilus | Шт. Биобактон |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 3 | Lactobacillus acidophilus | Шт. 1К В-2991 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 4 | Bifidobacterium animalis | Bb-12 |
| |(lactis) | |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 5 | Bifidobacterium bifidum | Шт. N 1 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 6 | Lactobacillus acidophilus | E.P. 317/402 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 7 | Lactobacillus casei | Шт. 163 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| | | R |
| 8 | Laclobacillus acidophilus | K/A - 08 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
| 9 | Saccharomyces cerevisiae | Шт. АлкоИст |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
|10 | Композиция бифидобактерий | B. bifidum, N ВКПМ Ac 1248(8-3); |
| | Bifidobacterium bifidum |B. longum, N Ac 1531 (ДВА-13), B. |
| | Bifidobacterium bifidum |bifidum 791 БАГ |
| | Bifidobacterium longum | |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
|12 | Lactobacillus paracasei, | Шт. Dalton |
| | subsp. paracasei | |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
|14 | Композиция Lactobacillus | Шт. 8P-A3 La + шт. 90TC-4 |
| | planlarum + Lactobacillus | |
| | fermentum | |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
|15 | Lactobacillus casei | Шт.-01 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
|16 | Lactococcus cremoris | Шт. 322 |
|---|--------------------------------|------------------------------------|
|17 | Streptococcus thermophilus | Шт. KTc 3 E.A. |
---------------------------------------------------------------------------
3.9. Для выявления ДНК генно-инженерно-модифицированных
микроорганизмов в пробах с различными уровнями содержания микробной
ДНК и ДНК пищевого субстрата используют два вида тест-систем:
- комплект N 1А для выделения ДНК из ферментных препаратов,
стартерных и заквасочных культур, БАД;
- комплект N 1Б для выделения ДНК из пищевых продуктов.
3.10. Выделение ДНК из бактериальных культур с помощью комплекта
N 1А включает лизис бактериальных клеток с последующим осаждением ДНК
на двуокиси кремния. Выделение ДНК из образцов пищевых продуктов с
помощью комплекта N 1Б включает предварительную обработку пробы
гомогенизированных образцов протеиназой К, лизис, дополнительную
обработку депротеинизирующим раствором и осаждение ДНК на двуокиси
кремния.
3.11. Для выявления ГММ и МГМА в пищевых продуктах используют
следующие материалы, оборудование, реактивы:
1) программируемый термостат (ДНК-амплификатор) типа "Терцик МС2"
или иные типы амплификаторов, зарегистрированные в Российской
Федерации в установленном порядке;
2) термостат, поддерживающий температуру +45 град.C, для пробирок
объемом 1,5 мл;
3) центрифуга со скоростью вращения ротора до 12 000 об./мин. для
пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "эппендорф";
4) встряхиватель вибрационный типа "вортекс" со скоростью
вращения до 3 000 об./мин.;
5) прибор для горизонтального электрофореза;
6) источник постоянного тока;
7) водяная баня с подогревом до +95 град.C или СВЧ-печь;
8) ультрафиолетовый трансиллюминатор;
9) очки/маска защитные;
10) холодильник бытовой электрический;
11) морозильная камера, обеспечивающая температуру (-20) град.C
или ниже;
12) гомогенизатор типа "SilentCrusher" или других моделей;
13) ступка фарфоровая с пестиком;
14) пинцет медицинский;
15) ножницы медицинские;
16) скальпель медицинский;
17) весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности;
18) дистиллятор;
19) анализатор потенциометрический;
20) облучатель бактерицидный настенный;
21) дозаторы с переменным объемом дозирования: 0,2 - 2,0 мм3 с
шагом 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 2 - 20 мм3 с шагом
0,01 мм3, 20 - 200 мм3 с шагом 0,1 мм3, 100 - 1000 мм3 с шагом 1 мм3,
2 - 10 см3 с шагом 0,1 см3;
22) пробирки типа "эппендорф" вместимостью 1,5 мл;
23) пробирки типа "эппендорф" для ПЦР вместимостью 0,5 мл;
24) наконечники полимерные объемом 1 - 200 мкл;
25) наконечники полимерные объемом 200 - 1000 мкл;
26) перчатки резиновые;
27) колбы плоскодонные конические разной вместимости;
28) цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100,
1000 см3;
29) воронки стеклянные;
30) штативы для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл;
31) комплект N 1А для выделения ДНК из ферментных препаратов,
стартерных и заквасочных культур, БАД к пище;
32) комплект N 1Б для выделения ДНК из пищевых продуктов;
33) комплект N 2 "Набор реагентов для выявления селективных
маркеров генетически модифицированных микроорганизмов";
34) комплект N 3 "Набор реагентов для выявления селективных
маркеров генетически модифицированных микроорганизмов";
35) реактивы:
- тритон X-100,
- гуанидина гидрохлорид,
- ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота),
- додецилсульфат натрия,
- суспензия двуокиси кремния,
- фенол водонасыщенный,
- хлороформ водонасыщенный,
- спирт этиловый ректификованный,
- ацетат аммония,
- протеиназа К,
- магния хлорид,
- калия хлорид,
- водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов (0,1 М),
- креозоловый красный,
- термостабильная ДНК-полимераза,
- масло вазелиновое,
- трис-ацетат,
- ледяная уксусная кислота,
- агароза для электрофореза,
- бромистый этидий,
- вода деионизированная.
3.12. Допускаются к использованию тест-системы, комплекты
(наборы) реагентов и материалы аналогичного назначения других типов,
разрешенные к применению в установленном порядке и с характеристиками,
обеспечивающими проведение исследований в соответствии с настоящими
Методическими указаниями.
3.13. Отобранные согласно установленному порядку и нормам отбора
проб (в соответствии с официально утвержденными нормативными и
техническими документами) образцы подготавливают к процедуре выделения
ДНК ГММ и МГМА двумя способами, в зависимости от их принадлежности к
группам пищевой продукции:
- из образцов проб ферментных препаратов, заквасочных и
стартерных культур, БАД готовят растворы 30%-й концентрации в
стерильной деионизированной воде. Для этого вносят 300 мг (мкл)
порошка или суспензии исходного образца в 700 мкл стерильной
деионизированной воды и перемешивают на вихревом смесителе в течение 3
- 5 с. При необходимости образец предварительно измельчают до
гомогенного состояния в ступке или с помощью гомогенизатора;
- из образцов других пищевых продуктов готовят растворы 50%-й
концентрации, для чего к 500 мг (мкл) пробы добавляют 500 мкл
стерильной деионизированной воды и перемешивают на вихревом смесителе
в течение 3 - 5 с. Твердый образец предварительно измельчают до
гомогенного состояния в ступке или с помощью гомогенизатора.
Подготовленные образцы используют для анализа в тот же день.
Допускается хранение образцов при температуре минус 20 град.C не более
2-х недель.
3.14. Выделение ДНК ГММ и МГМА из образцов исследуемой пищевой
продукции проводят с использованием комплектов (наборов) реагентов для
выявления селективных маркеров генно-инженерно-модифицированных
микроорганизмов. Допускается применение фенол-хлороформного или
другого адекватного метода экстракции ДНК.
3.15. Выделение ДНК из заквасочных и стартерных культур, БАД к
пище, ферментных препаратов проводят с использованием комплекта N 1А
"Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически
модифицированных микроорганизмов".
Комплект N 1А для выделения ДНК включает:
- лизирующий раствор, содержащий гуанидинтиоцианат (раствор 1) -
1 фл. (30 мл);
- раствор для отмывки, содержащий гуанидинтиоцианат (раствор 2) -
1 фл. (15 мл);
- раствор для отмывки (раствор 3) - 2 фл. (по 70 мл);
- суспензия двуокиси кремния - 1 пробирки (0,5 мл).
3.15. Выделение ДНК комплектом N 1А включает следующие этапы:
- исследуемый материал в объеме 700 мкл центрифугируют в течение
10 минут при комнатной температуре (+18 - 25 град.C) при 12000
об./мин.;
- удаляют 600 мкл надосадочной жидкости; оставшийся материал (100
- 110 мкл) тщательно перемешивают в пробирке на вортексе и добавляют к
суспензии 300 мкл раствора 1 и 5 мкл суспензии двуокиси кремния;
- пробы инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре,
периодически перемешивая на вортексе;
- пробы центрифугируют в течение 30 сек., при комнатной
температуре при 12000 об./мин., супернатант удаляют;
- к осадку добавляют 150 мкл раствора 2, встряхивают его на
вортексе и центрифугируют в течение 30 сек. при комнатной температуре
при 12000 об./мин., супернатант удаляют;
- к осадку добавляют 700 мкл раствора 3, встряхивают его на
вортексе и центрифугируют в течение 30 сек. при комнатной температуре
при 12000 об./мин., супернатант удаляют; проводят повторную процедуру
отмывки;
- дополнительным центрифугированием с последующим удалением
супернатанта убирают остатки раствора 3, пробы подсушивают в течение 5
мин. при температуре +45 град.C, оставляя пробирки открытыми;
- добавляют в каждую пробирку 50 мкл деионизированной воды,
перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 5 мин. при температуре
+45 град.C;
- пробы центрифугируют при комнатной температуре в течение 30
сек. при 12000 об./мин., водную фазу отбирают в другую пробирку и
используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции
амплификации либо хранят при температуре -20 град.C не более двух
недель.
3.16. Выделение ДНК ГММ и МГМА из пищевых продуктов проводят с
использованием комплекта N 1Б "Набор реагентов для выявления
селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов".
При повышенном содержании жиров проводится дополнительная экстракция
суспензией неполярных растворителей с водой для перевода содержащейся
в пищевом продукте ДНК в водную фазу, в которой и производится
дальнейшая очистка.
Комплект N 1Б для выделения ДНК из пищевых продуктов включает:
- раствор 1 (лизирующий буфер, pH 8,0) - 1 фл. (15 мл);
- раствор 2 (смесь фенола с хлороформом, 1:1) - 1 фл. (20 мл);
- раствор 3 (хлороформ) - 1 фл. (20 мл);
- раствор 4 (ацетат аммония 5 М) - 1 фл. (5,0 мл);
- раствор 5 (спирт этиловый 96%) - 4 фл. (по 20 мл);
- раствор 6 (спирт этиловый 75%) - 1 фл. (12 мл);
- раствор 7 (ТЕ-буфер, pH 8,0) - 1 фл. (6,0 мл);
- протеиназу К - 1 пробирки (3,0 мг).
3.17. Выделение ДНК комплектом N 1Б включает следующие этапы:
- раствор 1 прогревают при температуре +25 град.C до полного
растворения осадка, непосредственно перед применением к раствору 1
добавляют протеиназу К до концентрации 200 мкг/мл (0,001 г на 5,0 мл);
- в полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 мл вносят 100 мкл
гомогенизированного образца, добавляют 100 мкл раствора 1,
перемешивают на вихревом смесителе в течение 3 - 5 сек.;
- пробирки инкубируют при температуре +55 град.C в течение 40
мин.;
- добавляют 200 мкл (равный объем) раствора 2, перемешивают на
вихревом смесителе в течение 10 сек. и центрифугируют при комнатной
температуре (+18 - 25 град.C) в течение 5 мин. при 10000 - 12000
об./мин. (10000 - 13000 g);
- отбирают верхнюю (водную) фазу и вносят ее в полипропиленовую
пробирку вместимостью 1,5 мл, в эту пробирку добавляют 200 мкл (равный
объем) раствора 3;
- перемешивают на вихревом смесителе в течение 3 - 5 сек. и
центрифугируют при комнатной температуре 2 мин. при 10000 - 12000
об./мин. (10000 - 13000 g).
Отбирают водную фазу (200 мкл) и вносят ее в полипропиленовую
пробирку вместимостью 1,5 мл, в эту пробирку добавляют 40 мкл раствора
4 и 720 мкл (3 объема) раствора; перемешивают на вихревом смесителе в
течение 3 - 5 сек.;
- инкубируют при комнатной температуре в течение 40 мин.;
- центрифугируют при комнатной температуре (+18 - +25 град.C) в
течение 15 мин. при 12000 об./мин. (13000 g); супернатант удаляют;
- в пробирку вносят 100 мкл раствора 6;
- центрифугируют в течение 1 мин. при комнатной температуре при
12000 об./мин. (13000 g); супернатант удаляют; осадок сушат на воздухе
в течение 10 мин.;
- растворяют осадок в 50 мкл раствора 7; полученные образцы ДНК
используют для дальнейшего анализа.
3.18. Проведение ПЦР осуществляют с использованием комплекта N 2
реагентов для амплификации ДНК "Набор реагентов для выявления
селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов".
Комплект N 2 реагентов для амплификации ДНК включает:
- ПЦР-смесь 1 (реакционный буфер, смесь олигонуклеотидных
праймеров и дезоксинуклеозидтрифосфатов) - 8 пробирок по 1300 мкл;
- ПЦР-смесь 2 (термостабильная ДНК-полимераза) - 4 пробирки (200
мкл);
- масло минеральное - 8 пробирок по 1300 мкл;
- положительные контрольные образцы ДНК (плазмидная ДНК с
клонированным специфическим фрагментом соответствующих маркерных
генов) - 4 пробирки по 30 мкл;
- отрицательные контрольные образцы (плазмидная ДНК pET-9) - 4
пробирки по 30 мкл.
3.19. Проведение ПЦР с использованием комплекта N 2 включает
следующие этапы:
- перед началом работы вынимают из морозильной камеры комплект
реагентов для амплификации (кроме ПЦР-смеси 2), размораживают
содержимое пробирок при комнатной температуре, тщательно перемешивают
на вихревом смесителе в течение 10 сек. и помещают все пробирки в
холодильник;
- амплификационные пробирки вместимостью 0,2 (или 0,5) мл
маркируют в соответствии с маркировкой анализируемых образцов,
пробирки для положительного контрольного образца ДНК маркируют как ПК,
для отрицательного контрольного образца - ОК;
- рабочий раствор для проведения реакции амплификации готовят в
количестве, достаточном для анализа всех проб (при анализе N образцов
рабочий раствор готовится в количестве, необходимом для анализа N+1
образцов); для этого в пробирку вместимостью 1,5 мл вносят из расчета
на одну пробу по 25 мкл ПЦР-смеси 1 и по 2,0 мкл ПЦР-смеси 2;
тщательно перемешивают;
- в каждую пробирку с анализируемыми образцами и в пробирки ПК и
ОК вносят по 27 мкл рабочего раствора;
- в каждую пробирку добавляют по 1 капле (или 20 мкл)
минерального масла;
- в каждую пробирку с анализируемыми образцами вносят под масло
по 3,0 мкл исследуемой ДНК (используют наконечники с аэрозольным
барьером) и закрывают их.
В пробирку, маркированную ОК, внести под масло 3,0 мкл
отрицательного контрольного образца и закрыть ее:
- в пробирку, маркированную ПК, вносят под масло 3,0 мкл
положительного контрольного образца ДНК и закрывают ее;
- содержимое пробирок осторожно перемешивают пипетированием и
центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 сек. при 10000
об./мин. (11000 g);
- все пробирки устанавливают в блок амплификатора и проводят
амплификацию с учетом объема реакционной смеси, равного 30 мкл;
программа амплификации представлена в таблице 2:
-------------------------------------------------
| N | Температура | Время |Количество |
| п/п | | | повторов |
|-----|------------------|----------|-----------|
| 1 | +37 град.С | 10 мин. | 1 раз |
|-----|------------------|----------|-----------|
| 2 | +95 град.С | 10 мин. | 1 раз |
|-----|------------------|----------|-----------|
| 3 | +94 град.С | 30 сек. | 30 раз |
| |------------------|----------| |
| | +60 град.С | 30 сек. | |
| |------------------|----------| |
| | +72 град.С | 30 сек. | |
|-----|------------------|----------|-----------|
| 4 | +72 град.С | 5 мин. | 1 раз |
|-----|------------------|----------|-----------|
| 5 | +10 град.С | Хранение | |
-------------------------------------------------
3.20. Результаты ПЦР регистрируют методом электрофореза в 1,2%
агарозном геле, приготовленном на 1-кратном трис-ацетатном (ТАЕ)
буфере с использованием комплекта N 3 "Набор реагентов для выявления
селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов".
3.21. Детекция результатов ПЦР методом электрофореза включает
следующие этапы:
- приготовление ТАЕ буфера: 20 мл 50-кратного концентрированного
ТАЕ буфера вносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят до
метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают;
- приготовление 1,2% агарозного геля: 0,6 г агарозы растворяют в
50 мл 1 x ТАЕ буфера нагреванием в кипящей водяной бане до полного и
равномерного растворения, полученный раствор охлаждают до температуры
+60 град.C, добавляют 6 мкл 1% раствора бромистого этидия и
перемешивают (примечание: бромистый этидий является сильным мутагеном,
поэтому все манипуляции с ним и с агарозным гелем выполняют в
перчатках);
- проведение электрофореза: полученный раствор агарозы заливают в
кювету для геля согласно инструкции к прибору для горизонтального
электрофореза;
- для создания стартовых лунок в кювету помещают гребенку с
зубцами, полимеризация агарозы происходит при температуре ниже +42
град.C в течение 10 - 20 мин.;
- после застывания агарозы осторожно вынимают гребенку и
переносят гель в камеру для проведения электрофореза, в камеру
заливают 1 x ТАЕ буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем
составляла приблизительно 5 мм;
- вносят в лунки агарозного геля по 12,5 мкл амплифицированных
образцов, подключают к камере источник постоянного тока и проводят
электрофорез при напряжении 120 В в течение примерно 20 мин., помещая
стартовые лунки ближе к катоду;
- вынимают гель из камеры, переносят его на стекло
трансиллюминатора, включают трансиллюминатор и просматривают гель с
последующей видео- или фотодетекцией результатов. Фотоотпечатки или
оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600
точек на дюйм, прикладывают к протоколу проведения испытаний.
3.21. Интерпретацию результатов ПЦР проводят следующим образом:
- в положительном контрольном образце ДНК должна выявляться
полоса красно-оранжевого цвета, соответствующая по размеру
специфическим фрагментам селективных маркеров ГММ;
- в отрицательном контрольном образце полоса красно-оранжевого
цвета должна отсутствовать;
- наличие в анализируемом материале полосы красно-оранжевого
цвета, располагающейся строго на уровне полосы положительного
контрольного образца ДНК, свидетельствует о наличии в исследуемом
образце соответствующего селективного маркерного гена ГММ. При
отсутствии такой полосы результат считают отрицательным;
- наличие полосы красно-оранжевого цвета в отрицательном
контрольном образце, располагающейся на уровне полосы положительного
контрольного образца ДНК, считают результатом контаминации.
IV. Молекулярно-генетический анализ
пищевой продукции, полученной с использованием
генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов
и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно -
модифицированные аналоги, методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР) в реальном времени
4.1. Для выявления ГММ и МГМА в пищевых продуктах методом ПЦР в
реальном времени используют следующие материалы, оборудование,
реактивы:
1) амплификатор с оптической приставкой типа Rotor Gene - 3000,
ABI Prism 7000, iCycler IQ или отечественные аналоги;
2) компьютер, совместимый с программным обеспечением
амплификаторов с оптической приставкой;
3) оптические 96-луночные планшеты типа MicroAmp;
4) оптические крышки типа MicroAmp;
5) оптически прозрачные адгезивные пленки;
6) термостат, поддерживающий температуру +45 град.C, для пробирок
объемом 1,5 мл;
7) центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. для
пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "эппендорф";
8) встряхиватель вибрационный типа "вортекс" со скоростью
вращения до 3000 об./мин.;
9) очки/маска защитные;
10) холодильник бытовой электрический;
11) морозильная камера, обеспечивающая температуру (-20) град.C
или ниже;
12) гомогенизатор типа "SilentCrusher" или других моделей;
13) ступка фарфоровая с пестиком;
14) пинцет медицинский;
15) ножницы медицинские;
16) скальпель медицинский;
17) весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности;
18) дистиллятор;
19) анализатор потенциометрический;
20) облучатель бактерицидный настенный;
21) дозаторы с переменным объемом дозирования:
0,2 - 2,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 с шагом 0,01 мм3,
2 - 20 мм3 с шагом 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 с шагом 0,1 мм3, 100 - 1000
мм3 с шагом 1 мм3, 2 - 10 см3 с шагом 0,1 см3;
22) пробирки типа "эппендорф" вместимостью 1,5 мл;
23) пробирки типа "эппендорф" для ПЦР вместимостью 0,5 мл;
24) наконечники полимерные объемом 1 - 200 мкл;
25) наконечники полимерные объемом 200 - 1000 мкл;
26) перчатки резиновые;
27) колбы плоскодонные конические разной вместимости;
28) цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100,
1000 см3;
29) воронки стеклянные;
30) штативы для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл;
31) комплект N 2 (модифицированный) реагентов для амплификации
ДНК "Набор для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и
заквасочных культур, БАД к пище";
32) реактивы:
- тритон Х-100,
- гуанидина гидрохлорид,
- ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота),
- додецилсульфат натрия,
- суспензия двуокиси кремния,
- фенол водонасыщенный,
- хлороформ водонасыщенный,
- спирт этиловый ректификованный,
- ацетат аммония,
- протеиназа K,
- магния хлорид,
- калия хлорид,
- водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов (0,1 М),
- креозоловый красный,
- термостабильная ДНК-полимераза,
- масло вазелиновое,
- трис-ацетат,
- ледяная уксусная кислота,
- агароза для электрофореза,
- бромистый этидий,
- вода деионизированная.
4.2. Допускаются к использованию оборудование, инструменты и
материалы аналогичного назначения других типов, разрешенные к
применению в установленном порядке и с характеристиками,
обеспечивающими проведение исследований в соответствии с данным
документом.
4.3. Выделение ДНК ГММ и МГМА из заквасочных и стартерных
культур, БАД, ферментных препаратов и пищевых продуктов осуществляют в
соответствии с п. п. 3.13 - 3.17 настоящих Методических указаний.
4.4. ПЦР в реальном времени осуществляют с использованием
модифицированного комплекта N 2 реагентов для амплификации ДНК "Набор
реагентов для выявления селективных маркеров генетически
модифицированных микроорганизмов". Модификация предусматривает
использование в реакционной смеси не только праймеров, но и
флуоресцентно-меченых зондов, а также использование контрольной ДНК
ГММ с известной концентрацией в нескольких десятикратных разведениях.
4.5. Флуоресцентно-меченые зонды представляют собой
олигонуклеотиды, комплементарные амплифицируемой
последовательности-мишени, содержащие на 5`-конце флуорофор -
донорфлуоресцентного излучения, а на 3`-конце - его акцептор
(гаситель).
Нарастание флуоресцентного свечения наблюдают после физического
разобщения флуорофора и гасителя; разобщение флуорофора и гасителя
происходит при гибридизации с амплифицируемым фрагментом ДНК за счет
5`-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, разрушающей зонд после
его гибридизации с амплифицируемой последовательностью. Рост
регистрируемого флуоресцентного свечения происходит пропорционально
нарастанию числа ампликонов. Это позволяет регистрировать накопление
продуктов амплификации в реальном времени, а сравнение кинетики
флуоресценции ДНК-стандартов и исследуемого образца - определять
относительную концентрацию ДНК в образце.
4.6. Зонды синтезируют на автоматическом олигонуклеотидном
синтезаторе типа ASM102U фосфитамидным методом в режиме DMT-on,
используя фосфорамидиты и полимерный носитель типа Glen Reseach. Для
введения на 3`-конец зонда метки диметиламинофенилазобензойной кислоты
(DABCYL) в качестве гасителя флуоресценции используют фазу 3`-Dabcyl
CPG (типа Glen Reseach) в стандартном режиме синтеза. Введение на
5`-конец зонда флуорофора - донора флуоресценции - осуществляют
автоматическим синтезом, при использовании
6-карбоксифлуоресцеин-амидита (FAM-фосфорамидит). Первичную очистку
зондов осуществляют на колонках типа Poly-Pac, с последующей
дополнительной очисткой в полиакриламидном геле.
4.7. Для ПЦР в реальном времени используют ферменты
Taq-полимеразу Termo-Star, или Taq-полимеразу HotRescue,
инактивированные антителами, или полимеразу AmpliTaq Gold, обладающие
выраженной 5`-экзонуклеазной активностью.
4.8. Для проведения ПЦР в реальном времени используют систему,
состоящую из термоциклера (амплификатора) и флуоресцентного детектора
продуктов ПЦР в реальном времени.
4.9. Концентрацию ДНК ГММ в образце определяют путем сравнения
кинетики флуоресценции ДНК-стандартов в диапазоне разведений
контрольных препаратов (10-кратных разведений контрольной ДНК
известной концентрации) и исследуемого образца.
4.10. Амплификацию проводят по двухступенчатой программе,
объединяющей стадии отжига и элонгации в один этап; конечная
концентрация зондов в реакционной смеси - до 200 нМ.
Реакцию проводят в реакционной смеси объемом 50 мкл, включающей в
себя: десятикратный реакционный буфер, адаптированный к используемому
типу полимеразы; 250 мкМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов;
300 нМ каждого из праймеров; 200 нМ флуоресцентно-меченого зонда; 5
ед. Taq-полимеразы.
Амплификацию проводят по программе:
1) 1 цикл - 10 мин. -95 град.C;
2) 50 циклов: 20 с - 95 град.C, 1 мин. - 65 град.C.
4.11. Для постановки ПЦР в реальном времени в используемом
приборе для амплификации создают специальный протокол в соответствии с
инструкциями по пользованию; после завершения создания протокола
проверяют наличие в списке режима компенсации базовой линии ПЦР и
отмечают используемые флуоресцентные красители. Контрольную ДНК
используют в известных разведениях определенной концентрации
(стандартах); количество повторов стандартов определяют в соответствии
с руководством по эксплуатации прибора.
4.12. Детекцию результатов ПЦР в реальном времени производят
автоматически в рамках созданного протокола в графическом и цифровом
виде. Автоматический анализ данных происходит следующим образом:
последние 95% данных, собранных на каждом шаге, фильтруются
средневзвешенным методом. Для экспериментов по амплификации выбирают
циклы базовой линии для каждой кривой (образцы) индивидуально с учетом
общего оптимального значения порога. По значениям стандартов вычисляют
стандартную кривую, на основе которой определяют концентрации ДНК ГММ
в исследуемых пробах.
|